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上海雅吉生物科技有限公司
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WB實(shí)驗(yàn)小能手—樣本制備篇
2020-12-24 閱讀(4562)
蛋白質(zhì)印跡（Western Blot, WB）又稱為免疫印跡（Immunoblot），是利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）將樣品中分子量大小不同的蛋白分開(kāi)，然后通過(guò)電轉(zhuǎn)移的方法將凝膠中的蛋白定量地遷移并幾乎原位復(fù)制、固定到固相膜上，再利用抗原、抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)，特殊的抗體標(biāo)記技術(shù)以及相應(yīng)的檢測(cè)方法，進(jìn)而對(duì)目的蛋白進(jìn)行定性、相對(duì)定量檢測(cè)的技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)誕生于上世紀(jì)七十年代，近半個(gè)世紀(jì)以來(lái)經(jīng)久不衰。
WB實(shí)驗(yàn)流程分為樣本采集，蛋白樣品制備，上樣，凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育，洗膜，二抗孵育，洗膜，顯色（信號(hào)檢測(cè)）。作為一名實(shí)驗(yàn)汪是不是近又被到體無(wú)完膚？今天來(lái)和大家聊聊應(yīng)用廣泛幾乎人人都曾中槍的Western Blot實(shí)驗(yàn)—樣本采集和蛋白制備的相關(guān)知識(shí)和技巧。
一
樣本采集和保存
1. 對(duì)于動(dòng)物組織和植物器官，樣本較多或取樣時(shí)間間隔太長(zhǎng)則需先將樣本放入液氮速凍冷存；若未能及時(shí)進(jìn)行蛋白樣品制備，可液氮速凍后，存入-80℃保存約六個(gè)月或浸入液氮罐保存約一年。
2. 對(duì)于細(xì)胞和一些微生物樣本，可去除培養(yǎng)基后，加裂解液制備蛋白樣品；若未能及時(shí)制備蛋白樣品，去除培養(yǎng)基后，將其液氮速凍后保存于-80℃（約一個(gè)月）或保存于液氮（約三個(gè)月）。
3. 所有樣本均不建議保存于-20℃。-20℃時(shí)，組織、細(xì)胞內(nèi)的水會(huì)結(jié)晶，細(xì)胞活性和組織微觀結(jié)構(gòu)會(huì)受到傷害，生物大分子受到組織、細(xì)胞內(nèi)多種因素的影響，穩(wěn)定性可能會(huì)降低。
二
蛋白提取
一般為了提取到足夠的蛋白以及更容易地提取蛋白，需要準(zhǔn)備足夠量的樣本，要求樣本量為細(xì)胞>106個(gè)，組織>30mg，菌體濕重>10mg，植物>100mg，血清>50µL。蛋白提取的原則：低溫快速，裂解充分。
下面對(duì)一些常用樣本的蛋白提取過(guò)程進(jìn)行簡(jiǎn)單描述：
1. 細(xì)胞樣本
一般樣本為1×106～1×107個(gè)細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞量多少或不同細(xì)胞中蛋白含量的多少所加裂解液的量也不相同，一般1×106個(gè)細(xì)胞，加裂解緩沖液100~200µL，具體實(shí)驗(yàn)操作時(shí)參照以上比例，可進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。
1) 懸浮細(xì)胞：收集培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞，4℃條件下1000~3000rpm，離心3~5min，留下細(xì)胞沉淀，去除細(xì)胞培養(yǎng)基，然后用預(yù)冷的0.01M PBS（即1×PBS）輕洗2次，4℃條件下1000~3000rpm，離心3~5min，去除上清，取用細(xì)胞沉淀，按照上述參考比例加入適量裂解緩沖液，吹打混勻，冰上裂解15~30min。
2) 貼壁細(xì)胞：直接去除培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用預(yù)冷的1×PBS輕洗2次，去除PBS，加入適量裂解緩沖，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，連同裂解緩沖液一起收集，吹打混勻，冰上裂解15~30min?；蛘哌€有一種方法是直接用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，連同培養(yǎng)基一起收集，后續(xù)過(guò)程同懸浮細(xì)胞；再有一種方法，是用胰酶消化細(xì)胞后，收集細(xì)胞，離心沉淀，用預(yù)冷的PBS輕洗細(xì)胞沉淀，后續(xù)過(guò)程同懸浮細(xì)胞，但胰（蛋白）酶消化的方法不適用于目的蛋白為細(xì)胞膜上的膜蛋白，會(huì)造成影響。
2. 組織樣本
一般動(dòng)物組織樣本，按照1mg組織加入10µL裂解液的比例進(jìn)行添加，不同的組織蛋白含量也不同，需要調(diào)整添加量。去除組織樣本上的脂肪（可用預(yù)冷的眼科剪、鑷子去除）、血液（用預(yù)冷的PBS清洗）等雜質(zhì)，防止造成污染，產(chǎn)生干擾。然后對(duì)處理好的樣本，加入裂解緩沖液，用預(yù)冷的眼科剪在冰上將其剪碎，可以加入鋼珠后，高速振蕩研磨儀進(jìn)行破碎。對(duì)于骨、肌肉、皮膚、尾巴、韌帶組織等或硬度大或韌性強(qiáng)的樣本，可以先試著剪碎，再進(jìn)行液氮研磨后加入適量裂解液。組織樣本處理后，冰上放置15~30min。
3. 冰上放置裂解的同時(shí)，需要加入適量蛋白酶抑制劑來(lái)減少蛋白酶的水解作用，磷酸化蛋白的提取還需要加入蛋白磷酸酶抑制劑。
4. 冰上放置裂解后，建議再進(jìn)行超聲處理，經(jīng)過(guò)超聲處理，裂解更充分。
5. 如有特殊的樣本或者特殊的目的蛋白，常規(guī)方法難以提取，建議查閱相關(guān)文獻(xiàn)，參照文獻(xiàn)上的配方和步驟提?。蝗艉笪凑业较嚓P(guān)資料，可購(gòu)買商品化的試劑盒。
