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注意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

　　測定意義：

　　NP在一定的溫度和中性pH條件下，催化水解蛋白質(zhì)。由于其安全無毒、水解能力強(qiáng)、作用范圍廣等特點(diǎn)，中性蛋白酶常用于食品、飼料、化妝品和營養(yǎng)保健品生產(chǎn)。

　　測定原理：

　　中性條件下，NP催化酪蛋白水解產(chǎn)生酪氨酸；在堿性條件下，酪氨酸還原磷鉬酸化合物生成鎢藍(lán)；在680nm有特征吸收峰。

　　自備儀器和用品：

　　可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、水浴鍋、磁力攪拌器、可調(diào)式移液槍、1.5mL EP管和蒸餾水。

　　試劑組成和配制：

　　試劑一：液體×1 瓶，4℃保存。

　　試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加4mL蒸餾水溶解。

　　試劑三：粉劑×1 瓶，4℃避光保存。臨用前加入4mL試劑一，沸水浴中磁力攪拌溶解。

　　試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加20mL蒸餾水溶解。

　　試劑五：液體×1 瓶，4℃保存。

　　標(biāo)準(zhǔn)品：液體×1 支，0.25μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液，4℃保存。

　　粗酶液提取：

　　1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）冰浴勻漿，8000g，4℃離心10min，取上清，即粗酶液。

　　2. 血清或培養(yǎng)液：直接測定。

　　3. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

　　測定操作：

　　1.分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長到680nm，蒸餾水調(diào)零。

　　2.試劑二、試劑三和試劑四置于30℃水浴保溫30min。

　　3.對照管：取0.5mL EP管，加入20μL粗酶液，40μL試劑二，混勻后置于30℃水浴保溫10min；加入40μL試劑三，混勻后8000g，4℃離心10min；取40μL上清液，加入新的EP管，再加入200μL試劑四，40μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min，取200μL于微量玻璃比色皿/96 孔板，于680nm測定光吸收，記為A對照管。

　　4.測定管：取0.5mL EP管，加入20μL粗酶液，40μL試劑三，混勻后置于30℃水浴保溫10min；加入40μL試劑二，混勻后10000rpm 4℃離心10min；取40μL上清液，加入新的EP管，再加入200μL試劑四，40μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min，取200μL于微量玻璃比色皿/96 孔板，于680nm測定光吸收，記為A測定管。（注意與空白管不同，先加試劑三，后加試劑二）

　　5.空白管：取0.5mL EP管，加入40μL蒸餾水，200μL試劑四，40μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于680nm測定光吸收，記為A空白管。

　　6.標(biāo)準(zhǔn)管：取0.5mL EP管，加入40μL標(biāo)準(zhǔn)品，200μL試劑四，40μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于680nm測定光吸收，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。

　　注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要測定一次。

　　計算公式：

　　a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

　?。?）按蛋白濃度計算

　　NP活性單位定義：30℃每毫克蛋白每分鐘水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

　　NP活性（nmol/min/mg prot）= C標(biāo)準(zhǔn)品×（A測定管－A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V1）÷T= 3125×（A測定管－A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）÷Cpr

　?。?）按樣本質(zhì)量計算

　　NP活性單位定義：30℃每克樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

　　NP活性（nmol/min /g）=C標(biāo)準(zhǔn)品×（A測定管－A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）×稀釋倍數(shù)÷（W×V1÷V2）÷T= 3125×（A測定管－A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）÷W

　?。?）按照液體體積計算

　　NP活性單位定義：30℃每毫升樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

　　NP活性（nmol/min/mL）=C 標(biāo)準(zhǔn)品×（A測定管－A 對照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管）×稀釋倍數(shù)÷V1÷T= 3125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管）

　?。?）按照細(xì)胞數(shù)量計算

　　NP活性單位定義：30℃每104個細(xì)胞每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

　　NP活性（nmol/min /104cell）=C 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管）×稀釋倍數(shù)÷（細(xì)胞數(shù)量×V1÷V2）÷T= 3125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管）÷細(xì)胞數(shù)量

　　C 標(biāo)準(zhǔn)品：0.25 μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液；稀釋倍數(shù)：（20+40+40）÷40=2.5；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），注意該粗酶液不能直接用于蛋白質(zhì)含量測定，需要另外測定；建議

　　稱取同樣質(zhì)量的樣品，加入1mL 蒸餾水勻漿提取離心后，用本公司蛋白質(zhì)含量測定試劑盒

　　測定；W：樣品質(zhì)量（g）；V1：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積（mL），20μL=2×10 -2mL；V2：

　　粗酶液總體積（mL），1mL；T：催化反應(yīng)時間（min），10min。

　　b.使用96 孔板測定的計算公式如下

　?。?）按蛋白濃度計算

　　NP活性單位定義：30℃每毫克蛋白每分鐘水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

　　NP活性（nmol/min /mg prot）= C 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管）×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V1）÷T= 3125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管）÷Cpr

　?。?）按樣本質(zhì)量計算

　　NP活性單位定義：30℃每克樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

　　NP活性（nmol/min/g）=C標(biāo)準(zhǔn)品×（A測定管－A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）×稀釋倍數(shù)÷（W×V1÷V2）÷T= 3125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管）÷W

　　（3）按照液體體積計算

　　NP活性單位定義：30℃每毫升樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

　　NP活性（nmol/min/mL）=C 標(biāo)準(zhǔn)品×（A測定管－A 對照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管）×稀釋倍數(shù)÷V1÷T= 3125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管）

　?。?）按照細(xì)胞數(shù)量計算

　　NP活性單位定義：30℃每104個細(xì)胞每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

　　NP活性（nmol/min /104cell）=C 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管）×稀釋倍數(shù)÷（細(xì)胞數(shù)量×V1÷V2）÷T= 3125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管）÷細(xì)胞數(shù)量

　　C 標(biāo)準(zhǔn)品：0.25 μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液；稀釋倍數(shù)：（20+40+40）÷40=2.5；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），注意該粗酶液不能直接用于蛋白質(zhì)含量測定，需要另外測定；建議

　　稱取同樣質(zhì)量的樣品，加入1mL 蒸餾水勻漿提取離心后，用本公司蛋白質(zhì)含量測定試劑盒測定；W：樣品質(zhì)量（g）；V1：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積（mL），20μL=2×10-2mL；V2：粗酶液總體積（mL），1mL；T：催化反應(yīng)時間（min），10min。

　　注意事項：

　　臨用前配制的試劑配制好后4℃保存，并且3 天內(nèi)使用完畢。