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穩(wěn)定細胞株構(gòu)建
2021-1-6 閱讀(372)
穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系（穩(wěn)定表達細胞株）指在細胞中持續(xù)穩(wěn)定表達特定基因或干擾特定基因表達。穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的目的基因質(zhì)粒DNA整合到細胞染色體上，使細胞長期穩(wěn)定表達該基因。穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株包括多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株和單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。慢病毒感染目的細胞后，通過抗性基因篩選得到的細胞株是多個細胞克隆的組合。單克隆細胞株是從多克隆細胞中經(jīng)細胞克隆挑選得到的，由一個細胞擴增得到的細胞株。單克隆細胞株性狀統(tǒng)一，傳代過程中細胞的基因表達保持穩(wěn)定。
用轉(zhuǎn)染質(zhì)粒或病毒侵染的方法將構(gòu)建好的含靶基因的載體導入細胞，根據(jù)不同的基因載體中所含的抗性標志選用相應的藥物進行篩選混合陽性克隆。在陽性混合克隆的基礎上，得到單細胞長出的陽性單克隆，繼而得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。常用的真核表達載體的抗性標志物有嘌呤霉素（puromycin）、潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）。
篩選穩(wěn)定細胞株的兩種方法
1、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，單克隆方法篩選穩(wěn)定細胞系
對大多數(shù)細胞轉(zhuǎn)染效率較低。對于基因過表達，如果轉(zhuǎn)染效率達到40%，基因過表達尚可。但是對于基因干擾實驗，對轉(zhuǎn)染效率要求遠遠高于基因過表達，通常質(zhì)粒轉(zhuǎn)染無法滿足。
另外，質(zhì)粒游離于細胞質(zhì)中，很快降解，無法滿足較長時間的檢測項目；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染整合幾率極低，穩(wěn)定細胞株構(gòu)建耗時耗力，且得率很低，往往需要挑取單克隆株。
2、病毒感染篩選穩(wěn)定細胞株
病毒感染方法較質(zhì)粒轉(zhuǎn)染篩選單克隆方法更方便和高效，是目前主流的穩(wěn)定細胞系篩選方法。用慢病毒制備穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，由于其高效整合、高效轉(zhuǎn)錄、高效表達、宿主范圍廣，感染效率高，且與細胞染色體整合而不發(fā)生基因重排，是制備穩(wěn)定細胞株的理想載體。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株服務流程
1、載體構(gòu)建：將外源基因構(gòu)建到合適的載體上，如需病毒轉(zhuǎn)染，則包裝病毒。
2、篩選濃度測定：以 10-14 天細胞全部死亡的抗生素濃度為篩選濃度。
3、細胞接種：轉(zhuǎn)染實驗前天接種細胞，各種細胞的平板密度依據(jù)各種細胞的生長率和細胞形狀而定。進行轉(zhuǎn)染當天細胞應達到 60%-80% 覆蓋。
4、細胞轉(zhuǎn)染：用構(gòu)建好的載體（或包裝好的病毒）轉(zhuǎn)染目的細胞。
5、抗生素篩選。
6、鑒定篩選結(jié)果。
