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細胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測方法

2021-1-28  閱讀(386)

  細胞凋亡的早期形態(tài)學(xué)改變是核染色質(zhì)濃聚、固縮,聚集在核膜周邊,然后是胞漿濃縮、胞膜起泡,繼而細胞核裂解成若干碎片,細胞膜將胞質(zhì)和染色質(zhì)斷片包裹,胞漿內(nèi)形成多個膜結(jié)構(gòu)尚完整的“小泡”及 “凋亡小體” (apoptoticbody)。這不同于細胞壞死的細胞腫脹、胞膜破裂、細胞崩解。
 
  根據(jù)凋亡細胞固有的形態(tài)特征,至今為止,已經(jīng)設(shè)計了許多不同的細胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測方法。
 
  一、光學(xué)顯微鏡觀察
 
  凋亡細胞的主要特征為核染色質(zhì)致密深染,形成致密質(zhì)塊,有時可碎裂。在HE染色的組織切片中細胞體積縮小,胞質(zhì)致密、嗜酸性染色增強,并可形成凋亡小體。在組織中凋亡細胞常以分散單個形式存在,凋亡細胞與周圍細胞分離,不引起炎癥反應(yīng)。
 
  本方法簡便易行,但在細胞密集的組織中對于改變不典型的細胞判斷較困難,常缺乏較為特征的指標,具有較強的主觀性,重復(fù)性差。本方法可用于調(diào)亡現(xiàn)象的初步觀察,作為分析指標之一。
 
  檢測方法:細胞涂片或組織石蠟切片作HE染色或Giemsa染色,在高倍物鏡下觀察凋亡細胞的形態(tài)改變,結(jié)合顯微測量工具可作凋亡細胞計數(shù)。
 
  二、視頻時差顯微技術(shù)
 
  此方法用于細胞培養(yǎng),通過相差顯微鏡可動態(tài)觀察細胞凋亡的變化過程,尤其是觀察細胞表和外形的變化。凋胞與基質(zhì)分離,胞體變圓、收縮、出泡,有的細胞拉長,出現(xiàn)釘狀突起,特續(xù)數(shù)小時后細胞膜破裂,細胞溶解,通過連續(xù)觀察,本方法可養(yǎng)壑培養(yǎng)中的凋亡細胞,但不能用于病理組織。
 
  檢測方法:收集2×105細胞/ml培胞,置于多孔培養(yǎng)板,加入凋亡誘導(dǎo)劑,在帶有自動攝像裝置的相差顯微鏡下觀察凋亡細胞的動態(tài)改變,每隔分鐘30秒作序列攝影,連續(xù)24小時。如同進進行熒光染色,可參熒光晃微鏡下觀察和攝影。
 
  三、電子顯微鏡觀察
 
  雖然光學(xué)顯微鏡下可以看見胞膜起泡現(xiàn)象和凋亡小體,但凋亡細胞的形態(tài)學(xué)變化大多發(fā)生在超微結(jié)構(gòu),因此用光鏡觀察難以令人滿意,而透射電鏡可清楚地觀察到細胞結(jié)構(gòu)在凋亡不同時期的變化。電鏡形態(tài)學(xué)觀察是迄今為止判斷凋亡經(jīng)典、可靠的方法,被認為是確定細胞凋亡的金標準。
 
  缺點:
 
  (1)只能定性,不能定量;
 
  (2)標本處理過程復(fù)雜,設(shè)備相對昂貴,對檢查者的技術(shù)水平要求較高,不適于大批標本檢測;
 
  (3)在組織切片上進行電鏡觀察時,有時凋亡很難與正常細胞有絲分裂相鑒別,因為兩種情況下都可出現(xiàn)染色質(zhì)濃聚。如同時進行熒光染色,可彌補電鏡檢查的不足。
 
  檢測方法:透射電鏡標本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定,丙酮脫水,環(huán)氧樹脂包埋,超薄切片,醋酸枸椽酸電子又重染色,透射電鏡觀察。掃描電鏡標本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定,乙醇逐級脫水,CO2臨界點干燥,真空噴金,掃描電鏡觀察。
 
  四、流式細胞技術(shù)
 
  流式細胞儀檢測凋亡細胞是通過檢查其光射特征及熒光參數(shù)時行的。細胞穿過流式細胞儀的激光束集點時使激光發(fā)生散射,分析散射光可以提供細胞大小及結(jié)構(gòu)的信息。散射光包括前向散射光和左向角散射光兩種,前向散射光的強度與細胞大小、體積相產(chǎn),右向角射光的強度與細胞結(jié)構(gòu)的析射性、顆粒性(granu-larity)有關(guān)。
 
  細胞凋亡過程中出現(xiàn)的形態(tài)改變?nèi)缂毎櫩s、胞膜起泡、核濃縮和碎裂等可以使光散射特性發(fā)生改變。早期凋亡細胞主要表現(xiàn)為前向散射光減弱而右向角散射光增強或不變,前者反映了細胞的皺縮,后者反映了細胞的核逐縮及碎裂。晚期凋亡細胞的前向散射光和右向角散射光均減弱。
 
  由于光散射牧場生并非凋亡細胞的特異性指標,細胞的機械性損傷和細胞壞死也可以使前向散射光減弱。因此,只有將光散射特性的檢測與熒光參數(shù)的檢測結(jié)合起來才能準確地辨認凋亡細胞。
 
  細胞凋亡過程中核酸內(nèi)切酶在DNA分子核小體間的降解,導(dǎo)致小分子DNA漏出,核DNA含量下降,細胞熒光染色后作流式細胞儀分析,可以發(fā)現(xiàn)在DNA直方圖上正常二倍體細胞的Go/G1峰前出現(xiàn)一個亞二倍體峰(xub-G1峰,即AP峰--apoptotic peak),代表凋亡細胞。
 
  根據(jù)此亞二倍體峰可以計算凋亡細胞的百分率。此外,流式細胞術(shù)還可以通過測定線粒體膜的電位、溶酶體質(zhì)子泵的活性及細胞DNA/總蛋白質(zhì)比例等方法辨認凋亡細胞。
 
  檢測方法:獲取密度1×106細胞/ml左右的細胞懸液,精洗,固定,熒光染料染色,上流式細胞儀分析。


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