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丙烯酰胺凝膠電泳
2021-3-3 閱讀(309)
聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質的電泳方法。在這種支持介質上可根據(jù)被分離物質分子大小和分子電荷多少來分離。
聚丙烯酰胺凝膠有以下優(yōu)點：
①聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和N，N'甲叉雙丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝膠有 格子是帶有酰胺側鏈的碳-碳聚合物，沒有或很少帶有離子的側基，因而電滲作用比較小，不易和樣品相互作用。
②由于聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的物質，在聚合前可調節(jié)單體的濃度比，形成 不同程度交鏈結構，其空隙度可在一個較廣的范圍內變化，可以根據(jù)要分離物質分子 的大小，選擇合適的凝膠成分，使之既有適宜的空隙度，又有比較好的機械性質。一 般說來，含丙烯酰胺7-7.5%的凝膠，機械性能適用于分離分子量范圍不1萬至100萬物 質，1萬以下的蛋白質則采用含丙烯酰胺15-30%的凝膠，而分子量特別大的可采用含 丙烯酰胺4%的凝膠，大孔膠易碎，小孔膠則難從管中取出，因此當丙烯酰胺的濃度增 加時可以減少雙含丙烯酰胺，以改進凝膠的機械性能。
③在一定濃度范圍聚丙烯酰胺對熱穩(wěn)定。凝膠無色透明，易觀察，可用檢測儀直接測定。
④丙烯酰胺是比較純的化合物，可以精制，減少污染。合成聚丙烯酰胺凝膠的原料是丙烯酰胺和甲撐雙丙烯酰胺。丙烯酰胺稱單體，甲撐雙 丙烯酰胺稱交聯(lián)劑，在水溶液中，單體和交聯(lián)劑通過自由基引發(fā)的聚合反應形成凝 膠。
在聚丙烯酰胺凝膠形成的反應過程中，需要有催化劑參加，催化劑包括引發(fā)劑和 另速劑兩部分。引發(fā)劑在凝膠形成中提供始自由基，通過自由基的傳遞，使丙烯酰胺 成為自由基，發(fā)動聚合反應，加速劑則可加快引發(fā)劑放自由基的速度。常用的引發(fā)劑 和加速劑的配伍如下表：
聚合反應催化劑配伍
引 發(fā) 劑 | 加 速 劑 |
（NH4)2S2O8 | TEMED |
(NH4)2S2O8 | DMAPN |
核 黃 素 | TEMED |
注：(NH4)2S2O8，過硫酸胺 TEMED：N，N，N，N';四甲基乙二胺 DMAPN：β－二甲基胺基丙晴 用過硫酸銨引發(fā)的反應稱化學聚合反應；用核黃素引發(fā)，需要強光照射反應液， 稱光聚合反應。 聚丙烯酰胺聚合反應可受下列因素影響： 1、大氣中氧能淬滅自由基，使聚合反應終止，所以在聚合過程中要使反應液與空氣 隔絕。 2、某些材料如有機玻璃，能抑制聚合反應。 3、某些化學藥物可以減慢反應速度，如赤血鹽。 4、溫度高聚合快，溫度低聚合慢。 以上幾點在制備凝膠時必須加以注意。 凝膠的篩孔，機械強度及透明度等很大程度上由凝膠的濃度和交聯(lián)決定。每100亳升 凝膠溶液中含有單體和交聯(lián)劑的總克數(shù)稱凝膠濃度，常用T%表達；凝膠溶液中交聯(lián)劑 占單體和交聯(lián)體總量的百分數(shù)稱為交聯(lián)度，常用C%表示，可用下式計算：
公 式
a：丙烯酰胺克數(shù)； b：甲撐雙丙烯酰胺克數(shù)；m：緩沖液體積（毫升） 凝膠濃度過高時，凝膠硬而脆，容易破碎；凝膠濃度太低時，凝膠稀軟，不易操作。
交聯(lián)度過高，膠不透明并缺乏彈性；交聯(lián)度過低，凝膠呈糊狀。 聚丙烯酰胺凝膠具有較高的粘度，它不防止對流減低擴散的能力，而且因為它具有三 度空間網(wǎng)狀結構，某分子通過這種網(wǎng)孔的能力將取決于凝膠孔隙和分離物質顆粒的大 小和形狀，這是凝膠的分子篩作用。由于這種分子篩作用，這里的凝膠并不僅是單純 的支持物，因此，在電泳過程中除了注意電泳的基本原理以外，還必須注意與凝膠本 身有關的各種性質（網(wǎng)孔的大小和形狀等）?？赏ㄟ^下式計算來選擇適當?shù)哪z網(wǎng) 孔。
公 式
式中：P為網(wǎng)孔平均直徑，C為多聚體濃度，d為該多聚體分子直徑（若不是卷曲的分 子應為5A），K為常數(shù)，K值取決于漲膠的幾何構型，假如多聚體的鏈是以近似于直角 交聯(lián)的，則約為1.5根據(jù)此式，我們可以通過多聚體濃度C近似地計算出網(wǎng)孔直徑，例 如已知多聚體濃度為5%，其網(wǎng)孔平均直徑應為：
公 式
這樣的計算是粗略的，與實際情況有一定距離，有人測定了總濃度（T）為20%的丙烯酰胺液，在六種不同比例的雙丙烯酰胺存在 下，聚合后的網(wǎng)孔大小，發(fā)現(xiàn)孔徑與總濃度有關，總濃度愈大，孔徑相應變小，機械 強度增強，與總濃度不變時，甲叉雙丙烯酰胺（Bis)的濃度在5%時孔徑小，高于或 低于此值時，聚合體孔徑都相對變大，凝膠孔徑在凝膠電泳中是一個重要的參數(shù)，它 往往決定了電泳的分離效果。經過不斷的實踐，得到了如表3所示的經驗值，在一般情況下，大多數(shù)生物體內的蛋白質采用7.5%濃 度的凝膠，所得電泳結果往往是滿意的，因此稱由此濃度組成的凝膠為“標準凝 膠”。
對那些用于重要研究的凝膠，通過采用10%的一系列凝膠濃度梯進行預先試驗，以選出適凝膠濃度。
表3不同分子量范圍的蛋白質和核酸在凝膠電泳 中所選用的凝膠濃度百分率
物 質 | 分子量范圍 | 適用的凝膠濃度（%） |
蛋白質 | <10 1-4×104 4×10-1×105 1-5×105 >5×105 | 20-30 15-20 10-15 5-10 2-5 |
核酸 | <104 104-105 105-2×106 | 10-20 5-10 2-3.6 |
聚丙烯酰胺凝膠電泳可分為連續(xù)的和不連續(xù)的兩類，前者指整個電泳系統(tǒng)中所用緩沖 液，pH值和凝膠網(wǎng)孔都是相同的，后者是指在電泳系統(tǒng)中采用了兩種或兩種以上的緩 沖液，pH值和孔徑，不連續(xù)電泳能使稀的樣品在電泳過程中濃縮成層，從而提高分辨 能力。
蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小 和形狀等因素。如果加入一種試劑使電荷因素消除，那電泳遷移率就取決于分子的大 小，就可以用電泳技術測定蛋白質的分子量。1967年，Shapiro等發(fā)現(xiàn)陰離子去污劑 十二烷基硫酸鈉（SDS）具有這種作用。當向蛋白質溶液中加入足夠量SDS和巰基乙 醇，SDS可使蛋白質分子中的二硫鍵還原。由于十二烷基硫酸根帶負電，使各種蛋白 質—SDS復合物都帶上相同密度的負電荷，它的量大大超過了蛋白質分子原的電荷量， 因而掩蓋了不同種蛋白質間原有的電荷差別，SDS與蛋白質結合后，還可引起構象改 變，蛋白質—SDS復合物形成近似“雪茄煙”形的長橢圓棒，不同蛋白質的SDS復合物 的短軸長度都不一樣，約為18A，這樣的蛋白質—SDS復合物，在凝膠中的遷移率，不 再受蛋白質原的電荷和形狀的影響，而取決于分子量的大小，因而SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳可以用于測定蛋白質的分子量。
