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一、恒溫擴增技術的發(fā)展現(xiàn)狀

自1980年PCR技術發(fā)明后，基于PCR技術的核酸檢測迅速應用到臨床、食品、環(huán)境的檢測中，并成為核酸檢測的金標準。但PCR的檢測技術存在設備體積大、粗樣品耐受性差、反應時間長、靈敏度難以達到單copy等諸多缺點，已經(jīng)難以滿足現(xiàn)代核酸檢測的要求：速度快(<30min)、超靈敏度(1-5copy/test)、大體積粗制樣品直檢(20-50%反應體積樣本量)、野外操作、簡單化操作等方面的指標。 在過去的20年中科學家一直嘗試通過恒溫擴增的方法來實現(xiàn)上述目標，這其中包括RCA(rolling circle amplification)、LAMP(loop-mediated isothermal amplification)、RPA(recombinase polymerase amplification)、NASBA(nucleic acid sequence based amplification)、SDA(strand displacement amplification)、HDA (helicase dependent amplification)、TMA(transcription-mediated amplification)等新型核酸恒溫擴增技術。在這些恒溫擴增技術中，以2000年*報道的LAMP法尤為耀眼和引人關注，目前占據(jù)超過60%的恒溫檢測市場。核酸檢測對LAMP技術如此親賴，究其原因，得益于其它恒溫檢測技術難以達到LAMP技術的綜合性優(yōu)勢：

• 反應速度極快，優(yōu)化的引物組合可以達到15min內(nèi)檢測到單copy分子，檢測速度接近或超過RPA和NASBA；
• 能夠達到超敏檢測極限，1-5copy的分子能夠穩(wěn)定檢出，穩(wěn)定性*，其它任何恒溫技術難以達到如此穩(wěn)定的水平；
• 結(jié)果判讀形式的多樣化，適應各種環(huán)境和條件下的核酸快速檢測。LAMP擴增作為終點判讀形式，可不借助任何其它輔助設備，裸眼觀察檢出結(jié)果?；阝}黃綠素、HNB、紅黃變色、OG橙綠變色都可以肉眼觀察結(jié)果。LAMP同樣可借助濁度儀進行實時濁度分析。在反應體系中加入SYBR Green熒光染料后，可使用小型恒溫熒光儀進行實時檢測。以上這些結(jié)果判讀形式均可在野外等非標準實驗室進行，所需設備簡單、小巧、價格低廉、便于普及。除此外，傳統(tǒng)實驗室中的熒光定量PCR儀，同樣可進行LAMP檢測，可采用SYBR Green、MB探針法或LAMP TaqMan探針法，對于經(jīng)常操作PCR檢測的人員來講，可以無縫對接、無需更換設備。
• 對RNA病毒的漏檢率低，由于RNA病毒的突變率較高，在PCR檢測中個別突變對PCR的擴增影響較大，容易造成病毒漏檢的假陰性。而LAMP識別靶基因8個區(qū)段，在這些識別區(qū)段中個別的突變對LAMP擴增影響較小，不易產(chǎn)生漏檢。
• 試劑穩(wěn)定、易于使用。同RPA、NASBA等技術相比，LAMP與PCR法都采用單一酶(或雙酶)系統(tǒng)進行反應，生產(chǎn)批次穩(wěn)定、反應酶系統(tǒng)耐高溫，試劑穩(wěn)定性好。在檢測試劑中僅包含酶mix一管、引物/探針一管，使用方便，在熒光定量PCR機器上可方便的進行高通量檢測。而RPA、NASBA等系統(tǒng)需要多個復合酶，比例嚴謹、試劑穩(wěn)定生產(chǎn)困難、保存運輸條件苛刻、難以高通量應用。
• LAMP法對耐受雜質(zhì)能力。PCR、RPA、NASBA等擴增體系均需要進行核酸純化制備，在進行粗制品的直擴系統(tǒng)中，上樣量均較小(<10%)，無法大體積上樣，雜質(zhì)對這些擴增方法均影響較大。而LAMP法對大多數(shù)樣本的耐受性能達到20%以上，個別樣本的含量可以容忍到50%以上，如此大的上樣體積量，決定了LAMP具有更高的檢出率。
• 擴增反應同步病毒滅活，由于LAMP反應溫度在65℃的高溫條件下進行，在病毒液直擴中，反應過程中即可滅活病毒，降低耗材的污染風險。
• 高特異性，隨著LAMP用酶不斷改進、反應緩沖液的不斷優(yōu)化、探針技術的搭配、引物設計理念的不斷改善，LAMP的非特異性擴增獲得質(zhì)的提升，目前在優(yōu)化的LAMP體系中，假陽性的情況已經(jīng)得到*，假陽性比例接近甚至低于PCR方法。
• 多重熒光探針的應用。隨著Bst DNA聚合酶和反應緩沖體系的不斷改進、LAMP TaqMan技術的發(fā)明，多重LAMP體系得以建立。這種多重的LAMP技術，達到了金標準TaqMan PCR的多靶基因、內(nèi)參質(zhì)控樣本的相同性能，符合到臨床應用的標準。

二、建立核酸恒溫擴增技術平臺

于2014年啟動LAMP技術平臺的研發(fā)與搭建，基于分子工具酶研發(fā)經(jīng)驗和蛋白質(zhì)電子重構架技術，歷時6年時間打造出LAMP全系DNA聚合酶，包括：Bst2.0、Bst3.0、Bst4.0、Bst5.0、Bst7.0 DNA聚合酶。精心優(yōu)化的反應體系，打造出性能、高擴增效率、高特異性的IsoAmp Mix系列試劑，便于科研和診斷試劑的開發(fā)。上百萬次的測試，總結(jié)出更為高效的引物設計理念，為客戶提供免費的LAMP引物設計服務。多樣化的預混顯色試劑，滿足不同檢測需求，包括：可視化變色顯色(紅黃變色、OG變色、HNB變色)、濁度法、SYBR Green熒光法、恒溫熒光探針法、多重恒溫熒光探針法。除了提供恒溫擴增用酶和預混mix試劑外，協(xié)助客戶進行恒溫擴增檢測試劑研發(fā)。

三、 LAMP產(chǎn)品體系及應用

1. 原料基礎用酶原料酶列表(全系提供含甘油和無甘油的酶版本)

	擴增速度	逆轉(zhuǎn)錄活性	雜質(zhì)耐受性	dUTP識別能力	應用
Bst 2.0	**	**	**	****	DNA LAMP SDA反應
Bst 3.0	****	***	****	**	LAMP和RT-LAMP反應
Bst 4.0	****	*****	****	**	RT-LAMP用酶

2. 不同顯色方式的優(yōu)缺點比較

	紅黃變色	OG變色	HNB變色	濁度法	SYBR Green	恒溫熒光探針
結(jié)果判讀方式	裸眼可視	裸眼可視	裸眼可視	裸眼可視 濁度儀	恒溫熒光儀 定量PCR儀	恒溫熒光儀 定量PCR儀
反應速度	20-30min	15-20min	20-40min	25-30min	15-25min	15-30min
靈敏度	<5copy	<5copy	<50copy	<10copy	<5copy	<5copy
單copy檢出率	30%	30-50%	困難	30%	>50%	>50%
抗雜質(zhì)能力	★★	★★★★★	★★	★★★★★	★★★★★	★★★★★
假陽性控制能力	★★★	★★	★	★★★	★★★	★★★★★
高通量檢測能力	★★★★	★	★★★	★★★	★★★★★	★★★★★
易用性	★★★★	★★	★	★★★	★★★★★	★★★★★

3. 恒溫擴增預混Mix系列

顯色方式	檢測模板	試劑形式	推薦選用產(chǎn)品
可視化系列(紅黃變色)	DNA	液體	A3824-01
	RNA	液體	A3824-01
可視化系列(OG橙綠變色)	DNA	液體	A3824-02+A3821
	RNA	液體	A3824-02+A3821
可視化系列（HNB變色法）	DNA	液體	A3802
濁度法	DNA	液體	A3824-02
	RNA	液體	A3824-02
SYBR Green熒光法	DNA	液體	A3824-03
	RNA	液體	A3824-03
恒溫熒光探針法	DNA/RNA	液體	定制
		凍干	定制
多重恒溫熒光探針法	DNA/RNA	液體	定制
		凍干	定制