保存條件及有效期：一抗體-20℃保存，避免反復(fù)凍融，一年有效；其他試劑2-8℃避光封閉保存一個(gè)月。

本試劑盒適用于人、大、小鼠、兔等組織，產(chǎn)品規(guī)格及組成：

樣本要求：新鮮活檢樣本組織，中性福爾馬林或多聚甲醛，固定時(shí)間 12-48h，參照病理技術(shù)規(guī)范要求取材、脫水、石蠟包埋并制成蠟塊，蠟塊在常溫條件下保存有效期有 5 年。組織切片厚度為 3-5μm 并黏

附在防脫玻片上，輕拍切片架并用吸水紙吸干組織切片中的水滴，再放入 56-60℃恒溫箱中烘烤 2h 后，從恒溫箱中移出玻片放在溫室下冷卻。如果切片在室溫下（15-28℃）保存，為了良好的重現(xiàn)組織中的抗原分

布情況，請(qǐng)于切片制作后 7 天內(nèi)完成檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)操作步驟（以石蠟切片為例）

儀器、設(shè)備：

移液槍、免疫組化筆、水浴鍋、計(jì)時(shí)器、孵育濕盒、切片架、蓋玻片、光學(xué)顯微鏡、洗瓶等。

操作步驟

1. 脫蠟水化。將石蠟切片置于新鮮二甲苯脫中浸泡 15 分鐘，重復(fù)三次。去除多余的液體后，依次置于無水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇，各浸泡 5 分鐘，蒸餾水（或自來水）沖洗 5 分鐘。用 PBS 緩沖液（試劑 1，將干粉溶解于 1L 去離子水中）沖洗切片 5 分鐘，重復(fù)三次。

2. 抗原修復(fù)。將脫蠟水化后的組織切片置于燒杯（或修復(fù)盒）中的耐高溫塑料切片架上，加適量修復(fù)液 1× 檸檬酸鈉抗原修復(fù)液（試劑 2，將 100×檸檬酸鈉抗原修復(fù)液加去離子水稀釋成 1×檸檬酸鈉抗原修復(fù)液），液面要浸過切片組織一定高度，將修復(fù)盒置于沸水中煮沸修復(fù) 15 分鐘后取出玻片，自然涼至室溫。用 PBS 緩沖液沖洗切片 5 分鐘，重復(fù)三次。

注意：抗原修復(fù)時(shí)，修復(fù)液務(wù)必保證切片始終浸泡在液體內(nèi)，一般情況：修復(fù)液的量約為800mL/1 架。3.阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。用吸水紙擦干玻片，免疫組化筆在組織周圍畫圈，滴加50μL 內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑（試劑 3）到切片組織上以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育 30 分鐘，用 PBS 緩沖液沖洗切片 5 分鐘，重復(fù)三次。

4. 血清封閉。用吸水紙擦干玻片，滴加 50μL 正常山羊血清工作液（試劑 5），37℃封閉 20 分鐘，以減少非

特異性染色。

5. 一抗孵育。用抗體稀釋液（試劑 4）將一抗原液稀釋成工作液，用吸水紙擦干玻片組織周圍的液體，滴加適量抗體工作液，置于濕盒 4℃孵育過夜或 37℃孵育 1h-2h。

6. 復(fù)溫。4℃過夜后從冰箱拿出樣本，在室溫下孵育 15min 復(fù)溫（抗體孵育為 4℃過夜選用此步驟，如室溫孵育直接進(jìn)入下一步清洗）。用 PBS 緩沖液沖洗切片 5 分鐘，重復(fù)三次。

7. 二抗孵育。吸水紙擦干切片后滴加 50μL 生物素標(biāo)記的羊抗兔 IgG（試劑 6），37℃孵育 20  分鐘，用 PBS

緩沖液沖洗切片 5 分鐘，重復(fù)三次。

8. 三抗孵育。吸水紙擦干切片后滴加 50μL 辣根酶標(biāo)記的鏈酶卵白素孵育（試劑 7），37℃孵育20  分鐘，用 PBS 緩沖液沖洗切片 5 分鐘，重復(fù)三次。

9. 顯色。甩去 PBS 緩沖液，吸水紙擦干切片； 每張切片滴加新鮮配制的 DAB 工作液 50μL（試劑 8：試劑 9：試劑 1=1:1:18  比例配置），孵育 3-5min，光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果，切勿顯色過深；顯色后用自來水沖洗切片終止顯色。

10. 復(fù)染。滴加適量蘇木素染液（試劑 10）復(fù)染，孵育 1-5 分鐘，自來水沖洗 5 分鐘，滴加鹽酸酒精分化