食源性致病菌

食品安全問題是關(guān)乎人民生命健康和社會(huì)和諧的重大戰(zhàn)略問題，而食品致病菌是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致食品安全問題的主要因素。其中, 以、銅綠假單胞菌、單核增生李斯特菌、腸炎沙門氏菌、鮑曼不動(dòng)桿菌等為代表的食源性致病菌嚴(yán)重威脅著消費(fèi)者的健康, 由其引起的食源性疾病如腹痛、腹瀉以及嘔吐等癥狀近年來呈上升趨勢(shì)^[1]，世界衛(wèi)生組織調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在全球范圍內(nèi)每年約有6億例食源性疾病發(fā)生，其中有42萬人因此死亡。因此，盡早的發(fā)現(xiàn)食源性致病菌是防止食源性疾病暴發(fā)的有效手段。

基于細(xì)胞培養(yǎng)的方法盡管一直以來被認(rèn)為是食源性致病菌檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法需要經(jīng)過增菌、選擇性培養(yǎng)、純化、生化反應(yīng)鑒定等步驟^[2]，存在過程繁瑣，且檢測(cè)耗時(shí)長等問題，難以滿足目前的快速檢測(cè)需求。而基于抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)原理的檢測(cè)方法雖然操作相對(duì)簡單，但靈敏性不足、容易造成漏檢。因此，開發(fā)新型快速高效的食源性致病菌檢測(cè)技術(shù)是亟待解決的重要問題。

常規(guī)免疫檢測(cè)及核酸檢測(cè)原理

CRISPR/Cas系統(tǒng)快速檢測(cè)原理

CRISPR/Cas系統(tǒng)由成簇、規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）和關(guān)聯(lián)蛋白（CRISPR-associated protein，Cas）組成。CRISPR/Cas系統(tǒng)來源于細(xì)菌和古細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)^[4]。近些年發(fā)現(xiàn)的Cas12和Cas13蛋白在CRISPR RNA (crRNA)或向?qū)?RNA (single-guide RNA，sgRNA)引導(dǎo)下，除了具有識(shí)別并剪切特異靶標(biāo)的順式剪切活性外，還具有可被靶標(biāo)激活的反式剪切活性。即這些 Cas蛋白與crRNA在特異性識(shí)別靶標(biāo)后，可被激活針對(duì)ssDNA或ssRNA的反式剪切活性。基于此原理，可將反式剪切底物設(shè)計(jì)成合適的報(bào)告探針(如熒光-淬滅基團(tuán)修飾)，即可用于靶標(biāo)核酸檢測(cè)。

CRISPR/Cas技術(shù)檢測(cè)食源性致病菌

致病菌的CRISPR/Cas核酸傳感器檢測(cè)可分為兩大類：①通過增菌后提取基因組，結(jié)合核酸擴(kuò)增和Cas蛋白的剪切體系建立的核酸傳感器。②結(jié)合適配體實(shí)現(xiàn)致病菌向核酸的轉(zhuǎn)化，隨后直接或間接與CRISPR/Cas系統(tǒng)結(jié)合，建立相應(yīng)的傳感器^[5]。在上文中，我們提到了5種常見的食源性致病菌，接下來，編者將以這5種食源性致病菌為例，展開論述現(xiàn)有的CRISPR/Cas檢測(cè)系統(tǒng)的原理及進(jìn)展。

銅綠假單胞菌的雙重檢測(cè)

Gootenberg^[8]等基于重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù) (Recombinase Polymerase Amplification, RPA)和CRISPR/Cas13建立了RPA-CRISPR/Cas-雙重?zé)晒鈾z測(cè)系統(tǒng)。通過多重RPA擴(kuò)增，再將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄得到RNA靶標(biāo)，兩種不同的RNA靶標(biāo)分別與Cas13a/crRNA、Cas13b/crRNA結(jié)合并激活對(duì)應(yīng)Cas13蛋白的反式剪切活性。根據(jù)Cas13蛋白反式剪切探針的偏好性，采取Cas13a剪切poly U探針，Cas13b剪切poly A探針，兩種探針分別標(biāo)記不同的熒光基團(tuán)，從而通過檢測(cè)兩種熒光信號(hào)強(qiáng)度的變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)和銅綠假單胞菌的同時(shí)檢測(cè)。

RPA-CRISPR/Cas-雙重?zé)晒鈾z測(cè)系統(tǒng)對(duì)黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的檢測(cè)

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