溶酶體

溶酶體為單層膜蛋白包圍的內(nèi)含一系列酸性水解酶的小體。溶酶體中含有多種酶，如糖苷酶、酸性磷酸酶、彈性蛋白酶、組織蛋白酶等等，是物質(zhì)代謝的場所。

弱堿性胺選擇性聚集在胞內(nèi)低pH值的小室中，可用于研究溶酶體的生物合成和發(fā)病機理。其中的就是DAMP，它不發(fā)熒光，需要和抗DNP的抗體共同使用，來觀察染色模式。中性紅、吖啶橙等熒光探針也常用于酸性細胞器的染色，不過它們?nèi)狈μ禺愋浴?/p>

LysoTracker探針就是Invitrogen開發(fā)的向酸性熒光探針，用于標記和追蹤活細胞中的酸性細胞器。這些探針有幾個重要的特征：對酸性細胞器的高選擇性，在納摩爾濃度下能對活細胞有效標記。而且，LysoTracker探針有幾種不同的顏色，適合多色標記。

LysoTracker探針是細胞膜通透性的，一般聚集在球形的細胞器中。研究人員發(fā)現(xiàn)探針在極低濃度（～50 nM）下選擇性最佳。此外，較大的酸性細胞器在LysoTracker Red DND-99染色后，經(jīng)過甲醛固定仍保留其染色模式。

對于那些想研究溶酶體生物發(fā)生動力學(xué)的研究人員來說，LysoSensor探針可謂量身定做。LysoSensor染料是向酸性的探針，由于質(zhì)子化作用聚集在酸性細胞器中。質(zhì)子化也緩解了染料的熒光淬滅，使熒光強度增加。因此，LysoSensor在酸化的環(huán)境中表現(xiàn)出pH依賴的熒光強度增加，而LysoTracker探針的熒光則沒有明顯變化。

Invitrogen提供了5種LysoSensor試劑，pKa不同，顏色各異。LysoSensor Blue DND-167和LysoSensor Green DND-189的pKa值很低，處于酸性環(huán)境中才會發(fā)出熒光，而LysoSensor Green DND-153在中性pH下就發(fā)出很強的熒光。LysoSensor Yellow/Blue DND-160很特別，具有雙激發(fā)和雙發(fā)射峰，是pH依賴的。在酸性細胞器中，它主要發(fā)黃色熒光，而在弱酸性細胞器中，熒光則為藍色。LysoSensor Yellow/Blue DND-160曾與fluo-3 AM共用，來同時測量兔胃腺中H+ 和Ca2+，以確定類和cAMP依賴通路激活后胃酸分泌的動力學(xué)。

除了上面這些傳統(tǒng)的熒光探針，Invitrogen的Organelle Lights?熒光蛋白也是一個不錯的選擇。Organelle Lights是即用型的熒光蛋白載體，融合了信號肽，能將表達的熒光蛋白定位到亞細胞器中，如核、質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和過氧化物酶體等等。顏色有青、綠、橙、紅幾種。它通過改造的可用于哺乳動物細胞的桿狀病毒（BacMam virus）將熒光蛋白導(dǎo)入胞內(nèi)，不僅安全，而且適合多種細胞類型，包括原代細胞和神經(jīng)細胞。你只需要將試劑加到細胞中就行了，既不需要轉(zhuǎn)染，也不需要對細胞做任何處理，用起來相當(dāng)方便。

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注：探針標記細胞后，只能用熒光顯微鏡觀察，而不能用流式或熒光酶標儀檢測，因為在總細胞熒光中溶酶體熒光只占非常小的比例。