Hypoxyprobe, Inc.(缺氧探針公司)專注于研發(fā)非侵略性的缺氧標(biāo)志物(Hypoxia maker)和缺氧依賴性的細(xì)胞因子，所有產(chǎn)品皆基于Pimonidazole核心結(jié)構(gòu)來開發(fā)。使用Pimonidazole HCl作為缺氧標(biāo)記物，廣泛用在狗、大小鼠。缺氧探針試劑盒核心組分為：缺氧探針(Pimonidazole 或CCI-103F)和缺氧探針的抗體。不同試劑盒中的探針和抗體標(biāo)記不同。(可應(yīng)用于免疫熒光(IF)，免疫組化(IHC)，WB或流式細(xì)胞分析(FC))
 

　　1.問：什么是 pimonidazole HCl(Hypoxyprobe-1)的最佳溶劑？
 

　　答：pimonidazole HCl 是弱堿 pimonidazole 的鹽酸鹽，在水溶液中非常易溶，包括中性緩沖鹽水(116 mg/mL 或 400 mmol)。這允許在動(dòng)物研究中使用小體積(0.1-0.5 mL)進(jìn)行腹腔內(nèi)或靜脈注射 pimonidazole HCl。
 

　　2.問：用于缺氧標(biāo)記的 pimonidazole HCl 劑量應(yīng)該是多少？
 

　　答：pimonidazole HCl 在缺氧組織中的結(jié)合程度將取決于生物還原激活的速率以及組織對 pimonidazole HCl 的接觸程度(接觸 = 濃度 x 時(shí)間)。還原代謝的速率很難預(yù)測，但可以檢查接觸的影響。在以下計(jì)算中，濃度以 pimonidazole HCl(分子量 290.7)為單位給出。
 

　　體外接觸于 58mg/kg(培養(yǎng)基中的濃度)1 小時(shí)的球狀體觀察到強(qiáng)烈的缺氧染色。接觸 = 58mg/kg x 1 小時(shí) = 58mg/kg-小時(shí)。
 

　　在人體中，使用 0.5gm/m2(約 14mg/kg)的劑量可以獲得腫瘤組織和正常上皮中的強(qiáng)染色，其中 pimonidazole 的血漿半衰期為 5 小時(shí)。接觸 = 14 mg/kg x 5 小時(shí) = 70 mg/kg-小時(shí)。
 

　　在小鼠腫瘤組織中，使用 60 mg/kg 可以獲得缺氧的強(qiáng)染色，其中 pimonidazole 的血漿半衰期為 0.25 小時(shí)。接觸 = 60mg/kg x 0.25 小時(shí) = 15 mg/kg-小時(shí)。
 

　　總結(jié)來說，對于體型統(tǒng)一的小動(dòng)物，如實(shí)驗(yàn)室大鼠和小鼠，推薦使用 60 mg/kg 體重的 pimonidazole HCl 劑量，這是效果和經(jīng)濟(jì)性之間的良好平衡。在小鼠和大鼠中使用了 30 mg/kg 至 400 mg/kg 的劑量，沒有毒性或由于血流效應(yīng)導(dǎo)致的氧氣水平改變，但使用超過 100 mg/kg 的 pimonidazole 劑量時(shí)，觀察到在小鼠后腿植入的腫瘤中出現(xiàn)血流效應(yīng)。因此，在使用后腿腫瘤模型時(shí)，劑量 > 100 mg/kg 必須小心。對于體型不均勻的較大動(dòng)物，劑量通常基于表面積計(jì)算。對于人類，推薦劑量為 0.5 gm/m2，而狗的使用劑量為 0.28 gm/m2。
 

　　3.問：Hypoxyprobe-1 是否能穿透缺氧的大腦和腦腫瘤組織？
 

　　答：盡管 Hypoxyprobe-1 是水溶性的，但其相應(yīng)的游離堿(pimoindazole)具有 8.5 的辛醇-水分配系數(shù)，因此該標(biāo)記物可以自由穿透大腦和腦腫瘤組織。
 

　　大鼠腦腫瘤冰凍切片的免疫熒光染色。大鼠腦腫瘤冰凍切片的免疫熒光染色。血管：ME 9F1；紅色。缺氧：Pimonidazole 加合物；綠色。灌注：Hoechst 33342；藍(lán)色。正常大腦(N)和腫瘤組織(T)。原始放大倍數(shù)為 x 200。注意正常大腦中血管的規(guī)則模式與腫瘤組織中血管的無序排列(Bernsen et al, Journal of Neurosurgery 93: 449-454, 2000; by permission)。
 

　　4.問：pimonidazole HCl 是檢測體內(nèi)缺氧的最佳探針嗎？
 

　　答：pimonidazole HCl，即“金標(biāo)準(zhǔn)”免疫組化缺氧標(biāo)記物，具有真正的優(yōu)勢，包括高水溶性(在鹽水中為 116 mg/mL)，允許以小體積注射 ip 或 iv 給藥。像六氟化 CCI-103F 這樣的標(biāo)記物水溶性為 10 毫摩爾或更低，通常作為 ip 花生油和 DMSO 的乳液給藥，以避免血液稀釋。
 

　　固體 pimonidazole HCl 在室溫或 4°C 下非常穩(wěn)定(多年)。在 4°C 下避光保存的 pimonidazole HCl 濃縮水溶液也非常穩(wěn)定(多年)。小鼠和兔子對 pimonidazole 加合物的抗體在 4°C 下保存至少一年穩(wěn)定。
 

　　小鼠中 pimonidazole 的 LD50(7天) 為 728 mg/kg，將其歸類為低毒性的非危險(xiǎn)品。
 

　　盡管 pimonidazole HCl 非常水溶性，但作為游離堿的 pimonidazole 具有 8.5 的高辛醇-水分配系數(shù)，并且容易穿透所有組織，包括大腦。實(shí)際上，它在大多數(shù)組織中的積累比血漿水平高 3 倍，使其有效的組織濃度遠(yuǎn)高于其他 2-硝基咪唑缺氧標(biāo)記物。
 

　　Pimonidazole 的結(jié)合可以通過多種技術(shù)檢測，包括：冷凍固定組織切片中的免疫熒光；福爾馬林固定石蠟包埋組織切片中的免疫過氧化物酶染色；ELISA；或流式細(xì)胞術(shù)。
 

　　5.問：單克隆抗體對 pimonidazole 加合物是否可以用于小鼠組織？
 

　　答：是的。對于福爾馬林固定石蠟包埋的組織，我們推薦使用過氧化物酶 F(ab)2 二級抗體策略(見產(chǎn)品手冊)，它提供了非常干凈的背景，適用于多種動(dòng)物物種。
 

　　6.問：pimonidazole HCl 激活和結(jié)合到缺氧細(xì)胞的機(jī)制是什么？
 

　　答：Varghese et al.表明，缺氧細(xì)胞將 2-硝基咪唑結(jié)合到肽硫醇，如guguanggantai。目前對 pimonidazole 代謝的看法總結(jié)在下面的方案中。O2 與 pimonidazole 的第一個(gè)電子的添加競爭，這解釋了激活和結(jié)合的 pO2 依賴性。根據(jù)試管實(shí)驗(yàn)，估計(jì)大約 20% 的活化 pimonidazole 結(jié)合到細(xì)胞硫醇上，大約 80% 不結(jié)合但通過與水的反應(yīng)而斷裂。Pimonidazole 受氧化代謝的影響，導(dǎo)致容易排泄的 N-氧化物、硫酸鹽和葡萄糖醛酸衍生物(ST = 硫酸轉(zhuǎn)移酶；GT = 葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶)。這些氧化途徑似乎不影響 pimonidazole 作為缺氧標(biāo)記物的效用。
 

　　7.問：Hypoxyprobe 試劑盒中提供的 IgG1 抗體濃度是多少？
 

　　答：Hypoxyprobe-1 試劑盒中提供的耗盡雜交瘤溶液中小鼠 IgG1 單克隆抗體的濃度約為 60 ug/mL。
 

　　Hypoxyprobe-1 Plus 試劑盒中的 FITC 偶聯(lián) MAb；Hypoxprobe-1 Green 試劑盒；Hypoxyprobe-1 Red549 試劑盒；Hypoxyprobe-1 RedAPC 試劑盒；和 Hypoxyprobe-1 Biotin 試劑盒中的親和純化 IgG1 的濃度約為 500 ug/mL。
 

　　親和純化的兔子抗血清對 pimonidazole 加合物和未純化的兔子抗血清對 Hypoxyprobe-F6(CCI-103F)加合物中的活性 IgG 分子的濃度未知。
 

　　8.問：pimonidazole 結(jié)合是否能檢測慢性和急性缺氧？
 

　　答：在固體組織中發(fā)生兩類缺氧 - 擴(kuò)散限制的慢性缺氧和灌注限制的急性缺氧。慢性缺氧出現(xiàn)在由靠近血管的細(xì)胞消耗氧氣而產(chǎn)生的氧梯度的遠(yuǎn)端，腫瘤的情況是由血管樹中的 pO2 縱向梯度引起的局部氧氣供應(yīng)不足而加劇的( Dewhirst et al., Temporal changes in pO2 of R3230AC tumors in Fischer-344 rats, Int J Radiat Oncol Biol Phys 42: 723-726, 1998)。慢性缺氧的存在意味著組織中的細(xì)胞以與氧氣供應(yīng)無關(guān)的速率消耗氧氣，從而在遠(yuǎn)離血管的微小區(qū)域?qū)?pO2 推向非常低的水平。也就是說，大多數(shù)細(xì)胞具有“調(diào)節(jié)”的細(xì)胞表型特征，通過平穩(wěn)過渡到基于糖酵解的能量產(chǎn)生而適應(yīng)低 pO2(Dewhirst et al., Temporal changes in pO2 of R3230AC tumors in Fischer-344 rats, Int J Radiat Oncol Biol Phys 42: 723-726, 1998)。
 

　　與具有靜態(tài)、代謝控制的 pO2 梯度的慢性缺氧相比，急性缺氧與由血流不穩(wěn)定性引起的 pO2 波動(dòng)相關(guān)，腫瘤的情況是由短暫的血管阻塞造成的。急性缺氧的腫瘤細(xì)胞，由于是增殖的，可能比靜止的、慢性缺氧的細(xì)胞在治療上更相關(guān)。在正常組織中，波動(dòng)的缺氧與缺氧再灌注損傷相關(guān)。關(guān)于 pimonidazole 是否能檢測到慢性和急性缺氧，結(jié)合弱堿性取代基(pKa ≥ 8.0)的化合物在組織中濃縮約 3 倍于循環(huán)血水平。弱堿性化合物的這種性質(zhì)是基于細(xì)胞內(nèi)外 pH 差異對弱堿性化合物細(xì)胞內(nèi)濃度的影響。特別是，在 pH 7.4 時(shí)，弱堿性 2-硝基咪唑在細(xì)胞內(nèi)的濃度比細(xì)胞外濃度高 2 倍。這種濃度增加直接反映在缺氧細(xì)胞的放射增敏和用缺氧標(biāo)記物標(biāo)記的增加上。因?yàn)榻?jīng)歷波動(dòng)缺氧的細(xì)胞靠近血管并且 pH 相對較高，弱堿性、2-硝基咪唑缺氧標(biāo)記物如 pimonidazole 在這些細(xì)胞中濃縮，因此急性缺氧發(fā)作導(dǎo)致與缺乏弱堿性官能團(tuán)的缺氧標(biāo)記物相比，結(jié)合水平更高。通過這種方式，pimonidazole 及其類似物在檢測急性缺氧方面更youyue(Kleiter, et al. A comparison of oral and intravenous pimonidazole in canine tumors using intravenous CCI-103F as a control hypoxia marker. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 64: 592-602, 2006 for further discussion and literature cited)。
 

　　9.問：在 pimonidazole HCl 給藥后多久可以收獲感興趣的組織？
 

　　答：在收獲過程中組織變得缺氧，循環(huán)中的 pimonidazole 結(jié)合可能會(huì)在原則上給出缺氧的錯(cuò)誤測量。答案在于比較標(biāo)記和收獲期間組織對 pimonidazole 的接觸程度。接觸(pimonidazole 濃度 x 37°C 下的時(shí)間)在標(biāo)記期間很大，在收獲期間非常短，因?yàn)?pimonidazole 濃度限于收獲時(shí)組織中的濃度。低標(biāo)記濃度、快速收獲和立即在冷介質(zhì)中固定將消除可測量的非特異性結(jié)合水平。
 

　　在人類腫瘤研究中，活檢通常在 pimonidazole HCl 輸注后 16-24 小時(shí)進(jìn)行。人類中 pimonidazole 的血漿半衰期約為 5 小時(shí)，因此 16 到 24 小時(shí)代表循環(huán) pimonidazole 的 3 到 5 個(gè)血漿半衰期。這意味著在收獲時(shí) pimonidazole 的初始濃度為 1/8 到 1/32。這與活檢材料快速轉(zhuǎn)移到冷固定劑相結(jié)合，最小化了非特異性 pimonidazole 結(jié)合，如大多數(shù)靠近血管的細(xì)胞的低背景結(jié)合所示。
 

　　在一些人類腫瘤研究中，活檢在 pimonidazole HCl 輸注后 1.5 到 4 小時(shí)進(jìn)行，并立即在液氮中固定。這種方法也給出了靠近血管的細(xì)胞的低背景結(jié)合。盡管在輸注后 1.5 到 4 小時(shí)循環(huán)中的 pimonidazole 水平相對較高，但收獲的組織中對 pimonidazole 的接觸與體內(nèi)標(biāo)記期間對 pimonidazole 的接觸相比非常短。
 

　　人類腫瘤的經(jīng)驗(yàn)可以指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)研究。小鼠中 pimonidazole 的血漿半衰期通常為 0.25 小時(shí)。在這種情況下，收獲時(shí)間為 1-2 小時(shí)，與快速加入冷固定劑相結(jié)合，有效地消除了非特異性結(jié)合。這一結(jié)論對于涉及二氧化碳窒息的實(shí)驗(yàn)尤為重要，因?yàn)槿秩毖醯某掷m(xù)時(shí)間定義不清。更快速的anlesi技術(shù)適用于較短的收獲時(shí)間，只要進(jìn)行快速組織收獲并在冷固定劑中固定。
 

　　10.問：為什么將 pO2 閾值 ≤ 10 mmHg 設(shè)置為 pimonidazole 結(jié)合的基礎(chǔ)？
 

　　答：在固體組織中測量 2-硝基咪唑結(jié)合的 Km(O2) 是困難的。迄今為止zuihaode實(shí)驗(yàn)是 Gross 等人。在固體組織球狀體模型中，通過放射自顯影測量放射性標(biāo)記的 misonidazole 結(jié)合，與氧微電極測量的 pO2 進(jìn)行比較。由于 misonidazole 結(jié)合導(dǎo)致的顆粒密度在 10 mm Hg 以下急劇增加(Gross et al. Calibration of misonidazole labeling by simultaneous measurement of oxygen tension and labeling density in multicellular spheroids, Int. J. Cancer 61: 567-573, 1995)。Chou 等人發(fā)現(xiàn) pimonidazole 結(jié)合的 Km(O2) 與 HeLa 細(xì)胞中的 misonidazole 類似，并得出結(jié)論，10 mm Hg 也是固體組織中 pimonidazole 結(jié)合的合理閾值(Chou et al. Evidence that involucrin, a marker for differentiation, is oxygen regulated in human squamous cell carcinomas. Br. J. Cancer, 90: 728-735, 2004)。
 

　　固體組織的一個(gè)特征在稀疏的細(xì)胞培養(yǎng)中是不存在的，即氧氣消耗創(chuàng)造了非常陡峭的 O2 梯度，以至于不同 Km(O2) 被穿越的距離被縮短。例如，在肝組織中觀察到陡峭的 pO2 梯度，其中 pimonidazole 加合物的免疫染色從背景到強(qiáng)烈染色僅跨越幾個(gè)細(xì)胞直徑。與組織中存在陡峭的 pO2 梯度一致的是，氧氣調(diào)節(jié)蛋白如 involucrin 和碳ic anhydrase IX 的免疫染色模式與 pimonidazole 結(jié)合的模式非常相似，盡管氧氣調(diào)節(jié)蛋白的 Km(O2) 約為 15 mm Hg，而體外 pimonidazole 結(jié)合的 Km(O2) 為 2-4 mm Hg(Chou et al. Evidence that involucrin, a marker for differentiation, is oxygen regulated in human squamous cell carcinomas. Br. J. Cancer, 90: 728-735, 2004 for further discussion)。
 

　　11.問：體內(nèi) N-氧化是否會(huì)影響 pimonidazole 作為缺氧標(biāo)記物？
 

　　答：pimonidazole 中的哌啶基團(tuán)很容易被氧化成其 N-氧化物代謝物。原則上，這可能會(huì)影響 pimonidazole 作為缺氧標(biāo)記物的有效性。(Arteel et al. Reductive metabolism of the hypoxia marker pimonidazole is regulated by oxygen tension independent of the pyridine nucleotide redox state. Eur J Biochem, 253: 743-750, 1998 for a detailed discussion of the metabolism of pimonidazole)。在體內(nèi)，pimonidazole N-氧化物是通過黃素單加氧酶(FMO)的作用形成的。FMO 同工酶的分布因物種而異，產(chǎn)生不同的 N-氧化物血漿水平。有趣的是，pimonidazole 給藥的途徑(iv 或口服)對 N-氧化物的血漿水平影響很小(Kleiter et al. A comparison of oral and intravenous pimonidazole in canine tumors using intravenous CCI-103F as a control hypoxia marker. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 64: 592-602, 2006 for further discussion)。像過氧亞硝酸鹽這樣的強(qiáng)氧化劑，由超氧陰離子與一氧化氮(NO)反應(yīng)形成，也可以氧化 pimonidazole。然而，N-氧化物的形成似乎并沒有損害 pimonidazole 作為缺氧標(biāo)記物的有效性。
 

　　首先，N-氧化物的形成可以通過血液中的血紅蛋白-鐵復(fù)合物的還原作用以及組織還酶如huangpiaoling脫氫酶和還原型細(xì)胞色素 P-450 來逆轉(zhuǎn)，從而限制了 pimonidazole 因氧化而丟失(Walton et al. The reversible N-oxidation of the nitroimidazole radiosensitizer Ro 03- 8799. Biochem Pharmacol, 34: 3939-3940, 1985)。
 

　　其次，通過使用第二種缺氧標(biāo)記物，已經(jīng)表明 pimonidazole 標(biāo)記的缺氧程度與推薦用于缺氧標(biāo)記的 pimonidazole 血漿濃度無關(guān)。
 

　　第三，因?yàn)?pimonidazole 及其 N-氧化物衍生物對 anti-pimonidazole 抗體沒有交叉反應(yīng)性，N-氧化物不會(huì)干擾缺氧組織中 pimonidazole 加合物的檢測(Kleiter et al. A comparison of oral and intravenous pimonidazole in canine tumors using intravenous CCI-103F as a control hypoxia marker. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 64: 592-602, 2006 for further discussion)。
 

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