Di家族細(xì)胞膜熒光染料選擇區(qū)分DiD，DiO，DiI，DiR

DiI, DiO, DiD和DiR作為類長鏈的親脂性二烷基碳菁類染料（Dialkylcarbocyanines）熒光染料家族，用于標(biāo)記細(xì)胞膜以及其他脂溶性生物結(jié)構(gòu)。作為類環(huán)境敏感型熒光染料，當(dāng)它們與膜結(jié)合或者與親脂性生物分子（例如蛋白質(zhì)，雖然在水中其熒光強(qiáng)度很弱）結(jié)合時(shí)，其熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。旦進(jìn)入細(xì)胞后，它們在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)膜中逐步擴(kuò)散，于恰當(dāng)濃度條件下可將整個細(xì)胞均勻染色。這些染料具很高的淬滅系數(shù)，偏光依賴性和很短的激發(fā)壽命。

四種細(xì)胞膜染料的區(qū)別：

DiD染料是一族親脂性的熒光染料，可以用來染細(xì)胞膜和其它脂溶性生物結(jié)構(gòu)。當(dāng)與細(xì)胞膜結(jié)合后其熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)，這類染料有很高的淬滅常數(shù)和激發(fā)態(tài)壽命。一旦對細(xì)胞染色，染料在整個細(xì)胞膜上擴(kuò)散，最佳濃度時(shí)可以使整個細(xì)胞膜染色。

綠色熒光、親脂性羰花青DiOC18(3)被廣泛用作親脂示蹤劑。它在水里是弱熒光的，但當(dāng)嵌入膜時(shí)，它的熒光和光穩(wěn)定性都很好。

DiI是一種親脂性膜染料，進(jìn)入細(xì)胞膜后可以側(cè)向擴(kuò)散逐漸使整個細(xì)胞的細(xì)胞膜被染色。DiI在進(jìn)入細(xì)胞膜之前熒光非常弱，僅當(dāng)進(jìn)入到細(xì)胞膜后才可以被激發(fā)出很強(qiáng)的熒光。DiI被廣泛用于正向或逆向的，活的或固定的神經(jīng)等細(xì)胞或組織的示蹤劑或長期示蹤劑，通常不會影響細(xì)胞的生存力。

DIR是一個親脂性、近紅外熒光花青染料。這個染料常用于標(biāo)記細(xì)胞質(zhì)膜。兩個18-碳鏈插入到細(xì)胞膜，從而特定的、穩(wěn)定的細(xì)胞染色，幾乎不會發(fā)生細(xì)胞間的染料轉(zhuǎn)移?？梢杂靡掖寂渲闷鋬Υ嬉?。細(xì)胞染色通常使用的濃度時(shí)1-10uM，孵育10-20分鐘的。

它們的熒光顏色區(qū)分明顯：DiI(橙色熒光)，DiO(綠色熒光)，DiD(紅色熒光)和 DiR (深紅色熒光)這使得他們可以用來對活細(xì)胞進(jìn)行多色成像和流式分析。DiI和DiO可以分別用標(biāo)準(zhǔn)的 FITC和TRITC的濾光片。DiD可以用 633 nm He–Ne 激光器激發(fā)，有著比DiI更長的激發(fā)波長和發(fā)射波長，在細(xì)胞和組織染色中更有價(jià)值。 DiR的紅外熒光可以穿透細(xì)胞和組織，在活體成像中用來示蹤。

四種細(xì)胞膜染料的優(yōu)點(diǎn)：

1. 應(yīng)用廣泛：主要作用是標(biāo)記細(xì)胞膜，用于活的或固定的神經(jīng)元等細(xì)胞或組織的長期示蹤劑，同時(shí)還可以標(biāo)記其他疏水結(jié)構(gòu)，例如外泌體

2. 不會影響細(xì)胞的生存力

3. 體外培養(yǎng)的條件下可以存活很長時(shí)間

4. 在經(jīng)過固定的神經(jīng)元細(xì)胞膜上的遷移速率為 0.2-0.6mm/day

5. 在活的神經(jīng)元細(xì)胞膜上的的遷移速率為 6mm/day

Di家族熒光染料選擇小竅門：

DiI, DiO, DiD 和 DiR均可染色活細(xì)胞或固定細(xì)胞及組織（請您根據(jù)您的需求選擇相應(yīng)的探針），DiI比DiO熒光更亮；DiD，DiR（D12731）波長更長，更適合組織染色，DiA為親脂性氨基苯乙烯基染料（dialkylaminostyryl dye），常用于神經(jīng)元的示蹤，可與DiI聯(lián)合使用進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞的雙色標(biāo)記。研究發(fā)現(xiàn)，某些情況下當(dāng)DiO不能標(biāo)記固定組織時(shí)，DiA可得到良好標(biāo)記效果。DiA與磷脂雙層膜結(jié)合后，光譜遷移明顯加強(qiáng)。正由其發(fā)射光譜非常廣，在適當(dāng)?shù)臑V光片下，可以綠色、橙色，甚至紅色熒光被檢測到。沃博生物提供物美價(jià)廉的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品。

關(guān)于染料的使用注意事項(xiàng)

1.DiI 可以溶解于無水乙醇、DMSO 和 DMF，溶解度約為 1-2.5mg/ml，發(fā)現(xiàn)較難溶解時(shí)可以適當(dāng)用超聲處理以促進(jìn)溶解。

2.用于細(xì)胞膜熒光標(biāo)記時(shí)，DiI 的常用濃度為 1-25μM，的濃度為 5-10 μM。

3. DiI 可以直接染色活的細(xì)胞或組織，染色時(shí)間通常為 5-20 分鐘。

4. 染固定的細(xì)胞時(shí)，通常使用 4%多聚甲醛進(jìn)行固定，使用其它不適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ簳?dǎo)致熒光背景較高。

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