RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（膠體金試紙條型）使用說明書

（貨號(hào)：WLRN8206KIT）

原理概述：

本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)：在常溫恒溫下，特殊修飾的反轉(zhuǎn)錄酶利用特異性引物和模板RNA合成cDNA鏈，反應(yīng)體系中的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和DNA聚合酶以新合成的cDNA鏈為模板進(jìn)行快速核酸擴(kuò)增反應(yīng)。依賴nfo酶的作用，加入根據(jù)模版設(shè)計(jì)的特異的分子探針，使用膠體金技術(shù)（三明治夾心法）可以對(duì)zui終結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

本試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)時(shí)間短（僅需12 mins）等優(yōu)點(diǎn)，反應(yīng)組分為干粉狀態(tài)，操作簡(jiǎn)便，易于保存。

本試劑對(duì)設(shè)備要求低，金屬浴、水浴鍋等即可進(jìn)行反應(yīng)操作，無需購買PCR擴(kuò)增儀等價(jià)格高昂的專屬設(shè)備。

引物設(shè)計(jì)：

建議使用長(zhǎng)度在 30-35 bp的引物，引物過短會(huì)影響擴(kuò)增速度和檢測(cè)靈敏度；下游引物的5’端標(biāo)記一個(gè)修飾基團(tuán)（常用shengwusu）。引物設(shè)計(jì)避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)而影響擴(kuò)增；擴(kuò)增子長(zhǎng)度建議在150-300 bp，通常不超過500 bp。

熒光探針設(shè)計(jì)：

在上下游引物中間，設(shè)計(jì)一段長(zhǎng)度為46-52nt與目的片段互補(bǔ)的序列；5’端修飾一個(gè)抗原標(biāo)記（典型FAM）; 在5’端和3’末端的中部位置標(biāo)記一個(gè)dSpacer（si氫呋喃，THF），作為nfo的識(shí)別位點(diǎn)；3’末端標(biāo)記一個(gè)修飾基團(tuán)，例如胺基、磷酸基團(tuán)或C3-Spacer等。

試劑盒組成：

試劑盒儲(chǔ)存：

運(yùn)輸條件：低溫運(yùn)輸；

儲(chǔ)存條件：儲(chǔ)存溫度 ≤ -20 oC，避光保存，避免重壓、反復(fù)凍融；

產(chǎn)品有效期：12個(gè)月。

操作步驟：提前30分鐘將試劑盒所需組分取出，室溫融化，震蕩混勻。

1) 每個(gè)干粉反應(yīng)管加入29.4 μL A buffer（注意：A buffer需*融化混勻，否則會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)效果產(chǎn)生影響）；

2) 每個(gè)反應(yīng)管分別加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探針（引物和探針濃度為10 μM，對(duì)于多個(gè)反應(yīng)、步驟1和步驟2可以混合后再分裝至反應(yīng)管中）；

3) 向反應(yīng)管中依次加入11.5 μL ddH₂O和2 μL核酸模板（可根據(jù)核酸濃度調(diào)整加入的核酸模板體積，并相應(yīng)調(diào)整加入的ddH₂O體積，至模板與ddH₂O總體積為13.5 μL）；

4) zui后向反應(yīng)管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（對(duì)于多個(gè)反應(yīng)，建議將B buffer加至反應(yīng)管的蓋子內(nèi)側(cè)，上下顛倒反應(yīng)管8-10次混勻）；

5) 混勻后，將反應(yīng)液甩（或快速離心）至管子底部，然后立即將反應(yīng)管放入恒溫設(shè)備中37-39 oC孵育8-12 mins；

6) 反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL加入含有190 μL ddH₂O的離心管中，混合均勻后，將膠體金試紙條的樣品端插入離心管中平衡，5 mins內(nèi)觀察質(zhì)控線與檢測(cè)線判讀結(jié)果。

體系配制

注意事項(xiàng)：

1． 由于試劑盒靈敏度非常高，在進(jìn)行反應(yīng)時(shí)請(qǐng)注意避免微量核酸污染，并盡量考慮設(shè)置空白對(duì)照以確認(rèn)是否有核酸污染。

2． 試劑盒保質(zhì)期12個(gè)月。每次使用時(shí)，請(qǐng)取出實(shí)驗(yàn)所需的MIRA反應(yīng)單元的數(shù)量，置于冰浴條件下并在8小時(shí)內(nèi)使用；剩余部分，請(qǐng)置于存儲(chǔ)條件下。