6
胱天蛋白酶在細胞凋亡和細胞信號轉導中起重要作用。caspase-3（CPP32 / apopain）的激活對于凋亡的啟動很重要。半胱天冬酶3也被鑒定為藥物篩選靶標。半胱天冬酶3具有對肽序列Asp-Glu-Val-Asp（DEVD）的底物選擇性。該Amplite™Caspase-3分析試劑盒使用Ac-DEVD-AMC作為檢測caspase-3活性的熒光指示劑。AMC衍生的caspase底物被廣泛用于各種caspase活性的熒光檢測。通過胱天蛋白酶對AMC肽的切割產(chǎn)生強熒光的AMC，其在340-350nm的激發(fā)下在440-460nm下用熒光法監(jiān)測。該試劑盒可用于使用熒光酶標儀或熒光計連續(xù)測量細胞提取物和純化的酶制劑中caspase-3的活性。
| 熒光酶標儀 | |
| 激發(fā) | 350納米 |
| 發(fā)射 | 450納米 |
| 隔斷 | 420納米 |
| 推薦板 | 純黑色 |
| 組分A：Caspase 3/7底物（200X儲備液） | 1小瓶（250 µL） |
| 組分B：測定緩沖液 | 1瓶（50毫升） |
| 成分C：DTT（1M） | 1小瓶（600 µL） |
| 組分D：Ac-DEVD-CHO（胱天蛋白酶3/7抑制劑） | 1個小瓶 |
用測試化合物準備細胞（對于96孔板是100 µL /孔，對于384孔板是25 µL /孔）
加入等體積的Caspase 3/7分析工作溶液
在室溫下孵育1小時
監(jiān)測Ex / Em = 350/450 nm的熒光強度
重要說明
使用前，請在室溫下解凍組分A，B，C（如果需要，請解凍組分D）。
儲備溶液的制備
除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲存在-20°C下。避免重復凍融循環(huán)。
（可選）Caspase 3/7抑制劑Ac-DEVD-CHO儲備液（1 mM）：
直接向Caspase 3/7抑制劑Ac-DEVD-CHO（組分D）小瓶中添加100 µL DMSO（未提供）。該抑制劑可用于確認熒光信號強度與Caspase 3/7樣蛋白酶活性之間的相關性。
準備工作溶液
將50μL的200X Caspase 3/7底物原液（組分A）和100μL的1M DTT溶液（組分C）加入10 mL的測定緩沖液（組分B）中并充分混合。注意： 50μL的200X Caspase 3/7底物儲備液足以進行100次測定，每次測定的反應體積為100μL。遠離光線。
程序
通過在PBS或所需緩沖液中加入10 µL 10X測試化合物（96孔板）或5 µL 5X測試化合物（384板）來處理細胞。對于空白孔（沒有細胞的培養(yǎng)基），添加相應量的化合物緩沖液。
將細胞板在37°C，5％CO 2培養(yǎng)箱中孵育所需的時間（對于xishujian處理過的Jurkat細胞，需要4-6小時）以誘導凋亡。
加入100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的Caspase 3/7工作溶液。
在避光的條件下，在室溫下孵育平板至少1小時。注意：如果需要，可在室溫下添加測定溶液*分鐘，向選定的樣品中加入1 µL Caspase 3/7抑制劑Ac-DEVD-CHO的1 mM儲備液，以確認caspase 3/7樣蛋白酶的活性。
制動關閉，以800 rpm離心細胞板（特別是非粘附細胞）2分鐘。
在Ex / Em = 350/450 nm處監(jiān)測熒光增加。
13502 Amplite™熒光法Caspase 3/7活性檢測試劑盒 *藍色熒光* Amplite™ Fluorimetric Caspase 3/7 Assay Kit *Blue Fluorescence* 500 Tests 13503 Amplite™熒光法Caspase 3/7活性檢測試劑盒 *綠色熒光* Amplite™ Fluorimetric Caspase 3/7 Assay Kit *Green Fluorescence* 500 Tests 13504 Amplite™熒光法Caspase 3/7活性檢測試劑盒 *紅色熒光* Amplite™ Fluorimetric Caspase 3/7 Assay Kit *Red Fluorescence* 100 tests 13507 Amplite™熒光法Caspase 3/7活性檢測試劑盒 *黃色熒光* Amplite™ Colorimetric Caspase 3/7 Assay Kit *Yellow Color* 200 Tests 13510 Amplite™熒光法通用型基質金屬蛋白酶MMP活性檢測試劑盒 *綠色熒光* Amplite™ Universal Fluorimetric MMP Activity Assay Kit *Green Fluorescence* 1 kit 13511 Amplite™熒光法通用型基質金屬蛋白酶MMP活性檢測試劑盒 *紅色熒光* Amplite™ Universal Fluorimetric MMP Activity Assay Kit *Red Fluorescence* 1 kit 13512 Amplite™熒光法基質金屬蛋白酶MMP-3活性檢測試劑盒 *綠色熒光* Amplite™ MMP-3 Activity Assay Kit *Green Fluorescence* 1 kit
