天冬氨酸（或天冬氨酸）是帶負(fù)電荷的極性氨基酸。天冬氨酸在嘧啶生物合成的控制點(diǎn)，轉(zhuǎn)氨反應(yīng)，與天冬酰胺的相互轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致AMP的代謝途徑，尿素循環(huán)中起作用，并且是高siansuan，suansuan，異liangansuan和蛋氨酸的前體。它也參與蘋果酸天冬氨酸穿梭。Amplite™熒光天冬氨酸測(cè)定試劑盒提供了靈敏的熒光測(cè)定法，用于定量生物樣品中的天冬氨酸。天冬氨酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，通過(guò)酶偶聯(lián)反應(yīng)生成過(guò)氧化氫。用Amplite™Red底物監(jiān)測(cè)天冬氨酸產(chǎn)生的過(guò)氧化氫的量，通過(guò)熒光酶標(biāo)儀對(duì)天冬氨酸進(jìn)行定量。

1. 準(zhǔn)備測(cè)試樣品以及稀釋的天冬氨酸標(biāo)準(zhǔn)液（50 µL）

2. 加入等體積的工作溶液（50 µL）

3. 在37°C下孵育20-30分鐘

4. 監(jiān)測(cè)Ex / Em = 540/590 nm的熒光強(qiáng)度

重要說(shuō)明
使用前，請(qǐng)?jiān)谑覝叵陆鈨鎏准慕M件。為了獲得*效果，建議使用黑色印版。

儲(chǔ)備溶液的制備

除非另有說(shuō)明，否則所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。

1.天冬氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 mM）：
將100 µL ddH ₂ O加入天冬氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品瓶（組分E）中，制成10 mM天冬氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2. Amplite™Red底物儲(chǔ)備液（200X）：
將50 µL DMSO（組分F）添加到Amplite™Red底物（組分A）中，制成200X Amplite™Red底物儲(chǔ)備液。

配制標(biāo)準(zhǔn)溶液

為了方便起見(jiàn)，請(qǐng)使用我們的系列稀釋計(jì)

將10 µL 10 mM天冬氨酸標(biāo)準(zhǔn)液加到990 µL 1X PBS緩沖液中，得到100 µM天冬氨酸溶液（ASP7）。然后在1X PBS緩沖液中進(jìn)行1：3的系列稀釋，以得到系列稀釋的天冬氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（ASP6-ASP1）。

準(zhǔn)備工作溶液

1.轉(zhuǎn)換混合物溶液（100X）：
將50 µL ddH ₂ O加入轉(zhuǎn)換混合物（組分D）中，制成100X轉(zhuǎn)換混合物儲(chǔ)備溶液。

2. Amplite™Red工作溶液：
將5 mL測(cè)定緩沖液（組分C）加入一瓶酶混合1瓶（組分B1）中；混合均勻。將100μLddH ₂ O加入一個(gè)酶混合物2小瓶中（組分B2）; 混合均勻。將整個(gè)小瓶（100μL）的酶混合液2、25μL的200X Amplite™Red底物儲(chǔ)備液和50μL的100X Conversion Mix溶液轉(zhuǎn)移到Enzyme Mix 1瓶中并充分混合。 注意：  工作溶液不穩(wěn)定，請(qǐng)立即使用，并避免直接暴露在光線下。

程序

表1.黑色96孔微孔板中天冬氨酸標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試樣品的布局。ASP =天冬氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（ASP1-ASP7，0.1至100 µM）；BL =空白對(duì)照；TS =測(cè)試樣品。

表2.每個(gè)孔的試劑組成。

1. 根據(jù)表1和表2中提供的布局準(zhǔn)備天冬氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（ASP），空白對(duì)照（BL）和測(cè)試樣品（TS）。對(duì)于384孔板，每孔使用25 µL試劑代替50 µL。
   

2. 在天冬氨酸標(biāo)準(zhǔn)液，空白對(duì)照和測(cè)試樣品的每個(gè)孔中加入50 µL Amplite Red™工作溶液，以使天冬氨酸總測(cè)定體積為100 µL /孔。對(duì)于384孔板，將25 µL工作溶液加到每個(gè)孔中，總體積為50 µL /孔。注意：在pH 6.5至7.0下進(jìn)行天冬氨酸測(cè)定。
   

3. 將反應(yīng)混合物在37°C孵育20-30分鐘。
   

4. 用熒光板讀數(shù)器在Ex / Em = 540/590 nm（截止= 570 nm）下監(jiān)測(cè)熒光的增加。

數(shù)據(jù)分析

1e+41000100101- Dose-responseData legendGenerated with Quest Graph™Aspartate (uM)RFUHover mouse to interact

從空白標(biāo)準(zhǔn)孔獲得的讀數(shù)（RFU）用作陰性對(duì)照。從其他標(biāo)準(zhǔn)的讀數(shù)中減去該值即可得到基線校正值。然后，繪制標(biāo)準(zhǔn)讀數(shù)，以獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線和方程式。該方程式可用于計(jì)算天冬氨酸樣品。