磷酸酶催化的太陽hong磷酸鹽（SRP）水解產(chǎn)生太陽紅熒光團(tuán)，可以用633 nm激光激發(fā)?660 nm的發(fā)射光。盡管太陽紅很容易在633 nm處激發(fā)并發(fā)出約660 nm的紅色光，但SRP在633 nm處卻具有極小的吸收而沒有紅光，這使SRP成為zui敏感的NIR磷酸酶傳感器之一。請不要使用DMSO制備儲備溶液，因?yàn)樗鼤蟠笤黾訙y定背景。

平臺

1. 準(zhǔn)備并在Tris緩沖液（50 µL）中添加10-50 µM SunRed™磷酸鹽

2. 加入堿性磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)品和/或測試樣品（50 µL）

3. 在室溫或37°C下孵育30至120分鐘

4. 監(jiān)視Ex / Em = 620/660 nm處的熒光強(qiáng)度（截止640 nm）

重要說明
以下是溶液中堿性磷酸酶測定的推薦方案。該協(xié)議僅提供指南，應(yīng)根據(jù)具體需要進(jìn)行修改。

儲備溶液的制備

除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。

1. SunRed™磷酸鹽儲備溶液：
在無菌水中制備2至10 mM的SunRed™磷酸鹽儲備溶液。注意：應(yīng)立即使用儲備溶液。注意：請勿使用DMSO，ETOH或METH制備儲備溶液，因?yàn)樗鼤@著增加測定背景。注意：避光。

準(zhǔn)備工作溶液

SunRed™磷酸鹽工作溶液（2X）：
實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將SunRed™磷酸鹽固體溶解在無菌H ₂ O中，或在室溫下解凍等份的SunRed™磷酸鹽儲備溶液。在100 mM Tris緩沖液或您選擇的pH 8至9的緩沖液中，準(zhǔn)備2X的10至50 µM的工作溶液。建議使用終濃度為5至25μM的SunRed™磷酸鹽來測量溶液中的堿性磷酸酶活性。

程序

1. 在堿性磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)品，空白對照和測試樣品的每個(gè)孔中加入50 µL 2X SunRed™磷酸鹽工作溶液，以使總堿性磷酸酶測定體積為100 µL /孔。對于384孔板，在每個(gè)孔中加入25 µL樣品和25 µL 2X SunRed™Phosphate工作溶液。
   

2. 在避光的條件下，將反應(yīng)在所需溫度下孵育30至120分鐘。
   

3. 使用熒光板讀數(shù)器監(jiān)測Ex / Em = 620/660 nm（在640 nm處截止）的熒光增加。

數(shù)據(jù)分析

2.8e+32.1e+31.4e+37001010.1- Dose-ResponseData legendGenerated with Quest GraphALP (mU/mL)RFUHover mouse to interact

從空白標(biāo)準(zhǔn)孔獲得的讀數(shù)（RFU）用作陰性對照。從其他標(biāo)準(zhǔn)的讀數(shù)中減去該值即可得到基線校正值。然后，繪制標(biāo)準(zhǔn)讀數(shù)，以獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線和方程式。該公式可用于計(jì)算ALP樣本。

計(jì)算器

普通儲備溶液的制備

表1.將SunRed™磷酸鹽的特定質(zhì)量重構(gòu)至給定濃度所需的水量。請注意，該體積僅用于制備儲備溶液。有關(guān)適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)/生理緩沖液，請參閱樣本實(shí)驗(yàn)方案。