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監(jiān)測細(xì)胞增殖是評估細(xì)胞活力，細(xì)胞周期和遺傳毒性的zui可靠方法之一。檢測細(xì)胞增殖的一種基本方法是在細(xì)胞生長的S期過程中，在存在胸腺嘧啶核苷的情況下測量DNA合成。Bucculite™dU摻入細(xì)胞增殖測定試劑盒使用FOL-dU（胸苷的類似物）。FOL-dU在DNA合成過程中被摻入細(xì)胞DNA中。固定細(xì)胞后，通過我們的Buccutite™標(biāo)記技術(shù)用MTA-iFluor™488標(biāo)記摻入的FOL-dU。在FITC通道中可視化細(xì)胞中形成的iFluor™488標(biāo)記的DNA。Bucculite™dU摻入細(xì)胞增殖試劑盒提供了基于抗BrdU抗體的檢測和EdU點(diǎn)擊化學(xué)檢測的替代方法。
| 熒光顯微鏡 | |
| 激發(fā) | 490納米 |
| 發(fā)射 | 525納米 |
| 推薦板 | 黑墻/透明底 |
| 組件A：FOL-dU | 1個(gè)小瓶 |
| 組件B：iFluor™488-MTA | 1個(gè)小瓶 |
| 組分C：染色緩沖液 | 1瓶（20毫升） |
| 組分D：10X洗滌緩沖液 | 1瓶（10毫升） |
| 成分E：DMSO | 1小瓶（1毫升） |
| 成分F：赫斯特33342 | 1小瓶（50 uL，水中10 mg / mL） |
協(xié)議摘要
- 準(zhǔn)備細(xì)胞（對于96孔板為100 µL /孔，對于384孔板為25 µL /孔）
- 對于96孔板，以100 µL /孔添加2X FOL-dU工作溶液
- 在37ºC下孵育3小時(shí)
- 取出培養(yǎng)基，并在室溫下用100µL冰冷的90％甲醇的PBS溶液固定細(xì)胞15分鐘
- 除去固定液并用PBS洗滌3次
- 加入1X iFluor™488-MTA工作溶液（100 µL /孔）并在室溫下染色30分鐘。
- 除去每個(gè)孔中的工作溶液，并用1X洗滌緩沖液洗滌細(xì)胞3次。
- 加入100µL 1X洗滌緩沖液/孔，并用FITC濾光片組觀察紫外熒光顯微鏡。
重要說明
使用前，請?jiān)谑覝叵陆鈨鏊薪M件。
儲(chǔ)備溶液的制備
除非另有說明，否則所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。
1. FOL-dU儲(chǔ)備溶液（1000X）：
將500 µL DMSO（組分E）添加到FOL-dU（組分A）中制成1000X儲(chǔ)備溶液。注意：此1000X濃度是使用具有*FOL-dU濃度的HeLa細(xì)胞開發(fā)的。生長培養(yǎng)基，細(xì)胞密度，細(xì)胞類型變化和其他因素可能會(huì)影響標(biāo)記。我們建議測試一系列FOL-dU濃度，以確定適合您的細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)條件的*濃度。
2. iFluor™488-MTA儲(chǔ)備溶液（400X）：
將50 µL DMSO（組分E）添加到iFluor™488-MTA（組分B）中，制成400 X iFluor™488-MTA儲(chǔ)備溶液。
準(zhǔn)備工作溶液
1. 2X FOL-dU工作解決方案
在*培養(yǎng)基中將1000X FOL-dU儲(chǔ)備溶液稀釋500倍，以制備2X FOL-dU工作溶液。
2. 1X iFluor™488-MTA工作解決方案
將2.5 µL 400X iFluor™488-MTA儲(chǔ)備溶液添加到1mL染色緩沖液（組分C）中，以制備1X iFluor™488-MTA工作溶液。
3. 1X洗滌緩沖液
向9mL PBS中加入1mL 10X洗滌緩沖液（組分D），制成1X Washing Buffer。
程序
準(zhǔn)備細(xì)胞
- 對于貼壁細(xì)胞：將細(xì)胞在生長培養(yǎng)基中以10,000至40,000個(gè)細(xì)胞/孔/ 100 µL（對于96孔板）過夜，以2,500至10,000個(gè)細(xì)胞/孔/ 20 µL（對于384孔板）過夜。
- 對于非貼壁細(xì)胞：離心培養(yǎng)液中的細(xì)胞，并將細(xì)胞沉淀以1-2 X 106細(xì)胞/ ml（對于10個(gè)96孔板為10 mL）懸浮在培養(yǎng)液中。注意：應(yīng)單獨(dú)評估每個(gè)細(xì)胞系，以確定*細(xì)胞密度。
用FOL-dU標(biāo)記細(xì)胞
- 將等體積的2X FOL-dU工作溶液添加到包含要處理的細(xì)胞的培養(yǎng)基中，以在每個(gè)孔中獲得1X FOL-dU溶液。我們不建議更換所有培養(yǎng)基，因?yàn)檫@可能會(huì)影響細(xì)胞增殖速率。
- 在細(xì)胞類型的條件下將細(xì)胞孵育3小時(shí)。FOL-dU暴露于細(xì)胞的時(shí)間可以直接測量合成DNA的細(xì)胞。孵育時(shí)間取決于細(xì)胞生長速率。
細(xì)胞固定
- 孵育后，移去培養(yǎng)基，并向每個(gè)孔中加入100µL冰冷的PBS中的90％甲醇（未提供，甲醇/ PBS，v / v為90/10），并在室溫下孵育15分鐘。
- 除去固定緩沖液，并用PBS清洗每個(gè)孔中的細(xì)胞兩次。
染色細(xì)胞
- 在細(xì)胞板中加入100 µL /孔（96孔板）或50 µL /孔（384孔板）的1X iFluor™488-MTA工作溶液。在避光條件下，于室溫下將細(xì)胞與工作溶液孵育30分鐘。
- 除去每個(gè)孔中的工作溶液。
- 用1X洗滌緩沖液洗滌細(xì)胞3次，洗滌后每孔加入100µL洗滌緩沖液。注意：如果需要Hoechst 33342染色劑，請?jiān)?X洗滌緩沖液中制成5-10 µg / ml Hoechst 33342溶液并染色30分鐘。
- 使用帶有FITC濾光片組的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞中的熒光信號(hào)。
22305 Bucculite™dT摻入細(xì)胞增殖熒光成像試劑盒*綠色熒光* Bucculite™ dT Incorporation Cell Proliferation Fluorescence Imaging Kit *Green Fluorescence* 200 Tests 22315 Bucculite™dT摻入細(xì)胞增殖熒光成像試劑盒*紅色熒光* Bucculite™ dT Incorporation Cell Proliferation Fluorescence Imaging Kit *Red Fluorescence* 200 Tests 22320 Bucculite™dT摻入細(xì)胞增殖熒光成像試劑盒*深紅色熒光* Bucculite™ dT Incorporation Cell Proliferation Fluorescence Imaging Kit *Deep Red Fluorescence* 200 Tests 22400 Cell Meter™ 細(xì)菌活性檢測試劑盒 Cell Meter™ Bacterial Viability Assay Kit 200 Tests 22401 MycoLight™ 比率法細(xì)菌膜電位試劑盒 *紅色/綠色熒光* MycoLight™ Ratiometric Bacterial Membrane Potential Kit *Red/Green Fluorescence* 200 Tests
