鉀（K +）離子通道在調(diào)節(jié)基本生物過(guò)程（包括心率，激素和神經(jīng)遞質(zhì)分泌，水和電解質(zhì)平衡）中起重要作用。鉀離子通道已被認(rèn)為是包括心律不齊，疼痛，糖尿病，神經(jīng)功能障礙等在內(nèi)的疾病適應(yīng)癥的藥物靶標(biāo)。Tl +通過(guò)K +通道的滲透性已被廣泛用于測(cè)定K +通道。表達(dá)感興趣的K +通道的細(xì)胞（例如hERG，Kv1.3，Kir2.1，KATP）預(yù)先裝有Tl +敏感染料。該染料是非熒光的，并且對(duì)細(xì)胞膜是可滲透的。進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部后，非熒光AM酯染料會(huì)被內(nèi)源性酯酶裂解為帶負(fù)電荷的染料，并留在細(xì)胞內(nèi)部。當(dāng)將含有低劑量Tl +的刺激緩沖液添加到細(xì)胞中時(shí)，Tl +流過(guò)K +通道并與Tl +敏感染料結(jié)合，產(chǎn)生熒光信號(hào)。該信號(hào)與K +通道的活動(dòng)成正比。如果將拮抗劑或拮抗劑添加至細(xì)胞，則熒光信號(hào)分別降低或升高，以反映K +通道的抑制或刺激活性。

1. 在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中準(zhǔn)備細(xì)胞

2. 添加Tl-520 AM染料加載溶液（對(duì)于96孔板為100 µL /孔，對(duì)于384孔板為25 µL /孔）

3. 在37°C孵育1小時(shí)

4. 加入激動(dòng)劑/拮抗劑并在37°C下孵育30分鐘

5. 添加Tl ₂ SO ₄ / K ₂ SO ₄ 刺激溶液（96孔板為50 µL /孔，384孔板為12.5 µL /孔）

6. 監(jiān)測(cè)Ex / Em = 490/525 nm的熒光強(qiáng)度

重要說(shuō)明
請(qǐng)勿添加其他binguangshu。使用前，請(qǐng)?jiān)谑覝叵陆鈨鏊刑准M件。

除非另有說(shuō)明，否則所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。

1. TI-520 AM儲(chǔ)備溶液：
將20 µL（目錄號(hào)36550）或200 µL（目錄號(hào)36551和＃365552）的DMSO加入到TI-520 AM（組分A）的小瓶中，并充分混合。注意：未使用的TI-520 AM儲(chǔ)備溶液可以等分并保存在  <  -20  ^o C下。避光，并避免重復(fù)的凍融循環(huán)。

2.測(cè)定緩沖液（1×）：
添加1個(gè)10X毫升的Pluronic ^®  F127加（成分B）到9ml HHBS緩沖液（成分C）的并充分混合。注意：10 mL 1X分析緩沖液足以用于一塊板。分裝和儲(chǔ)存未使用10X的Pluronic ^®  F127加（成分B），在  <  -20  ^? C.避光和避免反復(fù)凍融。

3.無(wú)氯緩沖液（1X）：
在8 mL ddH ₂ O中加入2 mL無(wú)氯緩沖液（5X）（組分D），并充分混合。

4. Tl ₂ SO ₄溶液（未提供，Sigma Cat＃208191）：將
Tl ₂ SO ₄溶解在超純水中至終濃度為80 mM。注意：Tl ₂ SO ₄有毒。采取必要的預(yù)防措施，以防止吸入和皮膚接觸。

準(zhǔn)備工作溶液

1. TI-520 AM染料加載溶液：
將20 µL TI-520 AM儲(chǔ)備溶液（500X）加入10 mL的1X分析緩沖液中并充分混合。

2.刺激溶液（5X）：
在1X無(wú)氯化物緩沖液中用Tl ₂ SO4 稀釋配體（用于非電壓門控鉀通道）或K ₂ SO4（用于電壓門控鉀通道）。

表1.  參考（用于HEK293-KCNH ₂電池中的電壓門控hERG通道），Tl ₂ SO ₄和K ₂ SO ₄（用于電壓門控鉀通道）或配體（用于非電壓門控鉀通道）的濃度應(yīng)針對(duì)每個(gè)靶通道和細(xì)胞類型優(yōu)化化驗(yàn)。