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酶底物法與多管發(fā)酵法和紙片法測定水中糞大腸菌群方法比較
糞大腸菌群是總大腸菌群的一部分，又稱耐熱大腸菌群。生長于人與部分動物體內腸道中，水體中的糞大腸菌群主要來自糞便污染，因此通過測定水中糞大腸菌群的含量，可間接得出水體受糞便污染的情況，在環(huán)境監(jiān)測和衛(wèi)生防疫方面具有重要意義
本文對比三種不同糞大腸菌群的檢測方法，通過比較多管發(fā)酵法、紙片快速法和酶底物法的檢測結果，討論酶底物法檢測糞大腸菌群的可行性及應用。
一、檢測方法及原理
1、多管發(fā)酵法
將水樣接種于乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的發(fā)酵管中，在37±0.5℃下培養(yǎng)24±2 h進行初發(fā)酵試驗，大腸菌群生長繁殖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，產(chǎn)酸使乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中的p H降低，發(fā)酵管由紫色變黃色;產(chǎn)氣使發(fā)酵管中導管產(chǎn)生小氣泡，產(chǎn)酸或產(chǎn)氣則為陽性，否則為陰性。
將顯陽性的發(fā)酵管接種至EC培養(yǎng)液，在44.5±0.5℃下培養(yǎng)24±2 h進行復發(fā)酵，造成不利于自然環(huán)境中的大腸桿菌生長的條件，而糞大腸菌群將會在44.5℃下繼續(xù)存活生長繁殖，由此通過復發(fā)酵管中產(chǎn)氣情況判定陽性。
通過復發(fā)酵后顯陽性的發(fā)酵管數(shù)，查詢MPN表，通過統(tǒng)計學方法計算出糞大腸菌群濃度。
2、紙片快速法
通過將水樣接種于吸附了溴甲酚紫和2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑 (TTC) 以及乳糖等營養(yǎng)成分的無菌濾紙上，在44.5±0.5℃下培養(yǎng)18～24 h，當糞大腸菌繁殖產(chǎn)酸使溴甲酚紫變黃色，產(chǎn)氣使相應的脫氫酶催化底物TTC形成紅色的不溶性三苯甲臢 (TTF) ，在黃色背景顯示出紅色的斑點或紅暈，判定糞大腸菌群存在，該接種紙片顯陽性，通過查詢MPN表計算出相應濃度值。
3、酶底物法
將已加入培養(yǎng)基的水樣混勻與97孔定量盤，置于44.5±0.5℃培養(yǎng)24h，糞大腸菌能在該溫度產(chǎn)生β-半乳糖苷酶 (β-D-galactosidase) ，分解選擇性培養(yǎng)基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖 (ONPG) 生成黃色的鄰硝基beng酚，通過定量盤大小孔顯黃色數(shù)查詢酶底物法的MPN表，計算出糞大腸菌群的濃度。
二、實驗步驟
根據(jù)水樣污染程度選擇不同的稀釋倍數(shù)，將水樣接種于乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的發(fā)酵管中，在37±0.5℃下培養(yǎng)24±2 h進行初發(fā)酵試驗，產(chǎn)酸產(chǎn)氣顯陽性;將顯陽性的發(fā)酵管用3 mm接種環(huán)接種至EC培養(yǎng)液，在44.5±0.5℃下培養(yǎng)24±2 h進行復發(fā)酵，發(fā)酵管內小導管有氣泡則顯陽性，記錄陽性管數(shù)，查對應MPN表，計算結果。
1、紙片快速法
根據(jù)水樣污染程度，樣品按照三個10倍遞減的不同接種量接種，每個接種量分別接種5張紙片，共接種15張紙片。接種水樣應均勻滴加在紙片上，紙片充分浸潤、吸收水樣，用手在聚丙烯塑膜袋外側輕輕撫平，做好標記。接種后立即放置44.5±0.5℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后，通過紙片上顏色變化判定陽性紙片數(shù)，查詢對應MPN表，計算結果。
2、酶底物法
根據(jù)水樣受污染程度，進行樣品稀釋，將商品化酶底物培養(yǎng)基加入100 ml待測樣品中，充分混勻，*溶解后全部倒入97孔定量盤中，撫平定量盤背面，趕出氣泡，用程控定量封口機封口。放置于44.5±0.5℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后于標準陽性比色盤對比，根據(jù)陽性孔數(shù)查詢對應的MPN表，計算結果。
三、結果與討論
1、實驗結果與數(shù)據(jù)分析
實驗開始前對使用的玻璃器皿按要求進行滅菌操作，制備無菌水時檢驗純水質量并進行滅菌操作，并開啟實驗室紫外燈對細菌室滅菌2 h以上。
根據(jù)方法標準和《水和廢水監(jiān)測分析方法 (第四版) 》要求，分別用滅菌水對每批次樣品培養(yǎng)基 (培養(yǎng)紙片) 進行全程序空白和實驗室空白檢驗，均未檢出，亦無任何顏色或氣泡等明顯變化。
每次實驗均用大腸埃希氏菌和產(chǎn)氣腸桿菌做陽性、陰性對照，且大腸埃希氏菌對照組樣品均顯陽性，產(chǎn)氣腸桿菌對照組均顯陰性。
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