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乳酸菌微膠囊保護(hù)一直是食品科學(xué)與工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，但由于乳酸菌對(duì)酸、溫度、氧和外力等環(huán)境因素高度敏感,以及乳酸菌菌株個(gè)體差異性較大其有效包埋方法仍在探索中¹。內(nèi)源乳化法是近年來興起的種海藻酸鈉微膠囊制備方法,已陸續(xù)成功包埋乳酸菌、胰島素、活性酶、卡介苗、胰島細(xì)胞、微藻等生物活性組分,該方法具有粒徑可控、工藝易放大等優(yōu)點(diǎn),且制備過程中使用的都是無毒試劑和溶劑,因而內(nèi)源乳化法可用來制備物理特性可控的乳酸菌微膠囊².

海藻酸鈉(ALG),是由a-L-古羅糖醛酸(G）和β-D-甘露糖醛酸(M)兩種單體通過(1-4)糖苷鍵連接形成的線性嵌段共聚高分子,免疫原性低、生物相容性好,常用于包埋乳酸菌。但單一海藻酸鈉對(duì)乳酸菌的保護(hù)效果一般,復(fù)合壁材能填充海藻酸鈉凝膠的多孔結(jié)構(gòu),可有效提高微膠囊對(duì)乳酸菌的保護(hù)效果^l。魔芋葡甘聚糖(KGM),是主鏈由D-甘露糖和D-葡萄糖以β-1，4糖苷鍵鏈接的雜多糖,來源于中國特色經(jīng)濟(jì)作物魔芋,因其具有良好的成膜、熱溫度、酸穩(wěn)定等特性,而作為微膠囊壁材來包埋核酸³、胰島素⁴、酶⁵、精油⁶等生物活性物質(zhì),同時(shí)廣泛應(yīng)用于食品加工中,以改善食品口感、硬度和色澤等品質(zhì)^7-8。Wang等比較了AG和 ALG-KGM胰島素微膠囊的各項(xiàng)特性,發(fā)現(xiàn)添加KGM使得電鏡下微膠囊結(jié)構(gòu)更加緊實(shí),同時(shí)提高了微膠囊中胰島素的載藥量⁴.因而,本文將考察AG與KGM復(fù)配微膠囊對(duì)乳酸菌的保護(hù)效果。

另一方面,KGM分子量可能會(huì)對(duì) ALG-KGM微膠囊對(duì)乳酸菌保護(hù)效果產(chǎn)生重大影響。Yang等添加少量吐溫80,將不同粘度的KGM水解物做壁材,通過乳化噴霧干燥過程制備甜橙油微膠囊,研究發(fā)現(xiàn)中等粘度(200 mPa） KGM水解物對(duì)甜橙油包埋率⁶。高Chen等通過小鼠實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)KGM和KGM水解物均大大提高了小鼠腸道短鏈脂肪酸含量、雙歧桿菌數(shù)目而與原始KGM相比,KGM水解物益生效果更優(yōu)⁹.因而,本文進(jìn)一步考察了KGM分子量對(duì) ALG-KGM微膠囊保護(hù)乳酸菌效果的影響。

1材料與方法

1.1原料

11.1菌種

嗜酸乳桿菌( L. acidophilus CGMCCl268購自

中國普通微生物保藏管理中心

1.1.2培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基:菌萄糖20蛋白胨10g,牛肉浸膏10g,酵母浸膏5g醋酸鈉5g磷酸氫二鉀2g

檸檬酸三銨2g、MgSO_4.7H₂O 0.58g、MnSO₄  4H₂O 0.25g吐溫80 1m水1L pH 6.8-7.0

13主要試劑

AIG由美國 FMC BioPolymer公司提供;KGM由武漢清江魔芋制品有限公司提供;納米級(jí)CaCO3為分析純,購自中國上海振欣試劑廠;3號(hào)膽鹽、胃蛋白酶(3000Umg)和其它試劑均為分析純,購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4主要溶液

模擬胃液(SGJ):NaCl02%(mm),用鹽酸調(diào)pH至2.0,滅菌后,加入一定量的胃蛋白酶(032%m/m);

膽鹽溶液(BS):磷酸一氫鉀068%(m),膽鹽1.09%(mm),用氫氧化鈉調(diào)pH至68,滅菌備用;

磷酸鹽-氯化鈉緩沖溶液(PS):p7.0,磷酸氫二鈉磷酸二氫鈉0.1M,氯化鈉09%mm),滅菌備用

1.2主要儀器設(shè)備

Mastersizer200(光粒度儀,英國馬爾文儀器有限公司; Haake Rheostress6000旋轉(zhuǎn)流變儀,美國Scientific公司;PIMR2100高速剪切乳化機(jī),瑞士Kinematica公司;sxQ-1數(shù)顯直流無級(jí)調(diào)速攪拌器,鄭州長城科工貿(mào)有限公司;TGL20M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),長沙平凡儀器儀表有限公司;HZws智能恒溫恒濕箱,無錫華澤科技有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1,3.1菌體的收集

MRs培養(yǎng)基中,37℃下靜置培養(yǎng)嗜酸乳桿菌24h,冷凍離心10min(4℃、800g,棄上清,用無菌生理鹽水洗滌菌泥兩次后,重懸于無菌生理鹽水中。此時(shí)控制菌懸液細(xì)胞個(gè)數(shù)在10 CFU/ mL左右

1.3.2不同分子量KGM的制備

配制KGM溶膠(2%m/m,加入纖維素酶迸行酶解制備不同分子量的KGM,具體纖維素酶添加量見表1,在轉(zhuǎn)速為100r/mim的搖床中55℃下反應(yīng)6h沸水浴中滅酶10min.

13.3乳酸菌微膠囊的制備

內(nèi)源乳化法制備乳酸菌微膠囊的過程主要參照文獻(xiàn)中^10-11的方法,并在此基礎(chǔ)上有所改變。稱取一定量的AG、KGM和碳酸鈣粉末,緩慢加入水中,60℃下機(jī)械攪拌(250r/mim)3h配制含3%ALG,0.6%KGM和37.5mM碳酸鈣的混合液;取20mL上述混合液與10m菌體懸浮液,混合均勻;將其加入到含1%span的70mL大豆油中,300r/min攪拌15min形成油包水液滴;加入20mL大豆油(含0.18g冰醋酸,酸鈣摩爾比值為4),100r/min攪拌30min進(jìn)行微膠囊固化;加入200mL PS溶液,靜置30min吸走上層油相,分液漏斗分層,棄去油層,待大部分油滴除去后,過濾得AIG-KGM微膠囊。AIG微膠囊制備過程中沒有添加0.6%KGM,其余條件與ALG-KGM微膠囊相同。

1.3.4 ALG-KGM乳酸菌微膠囊粒徑特性的測定

通過激光粒度分析儀( Marstersizel2000來測定微膠囊粒徑大小和粒徑跨度系數(shù)。用超純水做分散劑折光率、樣品折射率和吸收率分別設(shè)定為1.33、1.52、0.1。粒徑跨度系數(shù)=D(v,90)-D(v,10)/D(y,50)其中D(v,90),D(v,10)和D(v,50)份別代表直徑在90%,10%和50%處的微膠囊累積體積。

1.3.5 AIG-KGM乳酸菌微膠囊機(jī)械強(qiáng)度和粘彈性的測定

微膠囊機(jī)械強(qiáng)度和粘彈性均在 Haake RheoStress 6000旋轉(zhuǎn)流變儀進(jìn)行測定,采用平行板鈦合金轉(zhuǎn)子P60 TiL,實(shí)驗(yàn)溫度為25.0±0.1℃。機(jī)械強(qiáng)度通過壓迫試驗(yàn)來測定:取3g微膠囊平鋪于平行板上,Gap初始間距設(shè)為1mm結(jié)束距離設(shè)為0.15m以0.005mm/s速度下壓,采集下壓過程中的法向應(yīng)力值。微膠粘彈性以其彈性儲(chǔ)能模量(G)和粘性損耗模量(G")來表征,通過應(yīng)力應(yīng)變掃描實(shí)驗(yàn)和小振幅動(dòng)態(tài)頻率掃描驗(yàn)來進(jìn)行測定:應(yīng)力應(yīng)變掃描實(shí)驗(yàn)確定線性粘彈區(qū)范圍,頻率設(shè)定為1H,應(yīng)變?cè)O(shè)定為0.19%-1000%;小振幅動(dòng)態(tài)頻率掃描:測定體系的彈性儲(chǔ)能模量(G)和粘性損耗模量(G")隨角頻率ω的變化,掃描頻率范圍為0.1~100rad/s,設(shè)定對(duì)數(shù)模式采集數(shù)據(jù)點(diǎn)。

1.3.6乳酸菌包埋率的測定

乳酸菌包埋率的測定主要參照文獻(xiàn)中^10-11的方法。將1g微膠囊加入到9g PS容液中,用高速均質(zhì)機(jī)(1000r/min.30S)破碎該微膠囊混合液,搖床中37℃、100r/min下?lián)u晃30min取1mL該破碎混合液,用PS溶液稀釋后,涂布于MRS培養(yǎng)基上,37℃、厭氧條件下培養(yǎng)48h后計(jì)數(shù),計(jì)算乳酸菌活細(xì)胞包埋數(shù)。同時(shí),取包埋前菌懸液,稀釋、涂布平板、培養(yǎng)計(jì)數(shù),計(jì)算細(xì)胞總菌數(shù)。乳酸菌包埋率(EY)可表示為:

1.3.7模擬胃液菌體存活率的測定

模擬胃液菌體存活率的測定主要參照文獻(xiàn)中^10-11的方法。將1g微膠囊加入到9g模擬胃液(SGJ)中,搖床中37℃、100r/min下溫育2h;用高速均質(zhì)機(jī)(1000r/min,30s)破碎該微膠囊混合液;取1mL破碎混合液于4℃、10000g的條件下冷凍離心20min棄去上清液,加入1mLPs溶容液振蕩均勻,稀釋、涂布平板、培養(yǎng)計(jì)數(shù),計(jì)算模擬胃液乳酸菌存活數(shù)。同時(shí),以生理鹽水替換模擬胃液,其它步驟不變,計(jì)算空白對(duì)照中菌體存活數(shù)。模擬胃液菌體存活率可表示為:

1.3.8膽鹽菌體存活率的測定

膽鹽菌體存活率的測定主要參照文獻(xiàn)中^10-11的方法。將1g微膠囊加入到9g膽鹽溶液(BS)中,搖床中37℃100r/min下溫育0.5h后;用高速均質(zhì)機(jī)(1000r/min,30s)破碎該微膠囊混合液;取1mL破碎混合液于4℃、10000g的條件下冷凍離心20min,棄去上清液,加入1mL Ps溶液振蕩均勻,稀釋、涂布平板、培養(yǎng)計(jì)數(shù),計(jì)算膽鹽溶液乳酸菌存活數(shù)。同時(shí),以生理鹽水替換膽鹽溶液,其它步驟不變,計(jì)算空白對(duì)照中菌體存活數(shù)。膽鹽菌體存活率可表示為

1.3.9數(shù)據(jù)分析與處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)差異顯著性用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析,ANOVA程序用于方差分析,當(dāng)p0.05時(shí)認(rèn)為平均值之間有顯著差異?；貧w分析使用 Excel2007中的“數(shù)據(jù)分析回歸”來確定模型方程,相關(guān)系數(shù)R表示變量之間的密切關(guān)系,R越接近1,表明變量之間的線性關(guān)系越密切。

2結(jié)果與討論

纖維素酶是復(fù)合酶,主要由3種酶組成:內(nèi)切β-14葡聚糖酶、外切β-1,4-葡聚糖酶和β葡萄糖苷酶¹²。纖維素酶法降解KGM的主要原理為:利用內(nèi)切B-1，4-葡聚糖酶對(duì)KGM中的B-1，4-葡萄糖健的破壞作用,將KGM切割成許多短鏈。該方法簡單易行,在文獻(xiàn)中多次報(bào)道⁶。由表1可以看出,通過設(shè)定不同的酶底比梯度,成功將KGM從起始分子量8.11×10⁵降解到8.03×10³,且各組分間分子量成梯度下降的趨勢。為區(qū)分各組分區(qū)別,將各組分由分子量從大到小的順序命名為KGM-0、KGM-1、KGM-2、KGM3、KGM-4.

如表2所示,AG微膠囊平均粒徑為309pm,當(dāng)向AG中添加KGM后, ALG-KGM微膠囊粒徑顯著增加至412489μm,但不同分子量 KGM-ALO微膠囊間的粒徑差異不顯著。同樣地,與AG微膠囊相比, ALG-KGM微膠囊粒徑跨度系數(shù)顯著增加,KGM分子量對(duì) KGM-ALG微膠囊間的粒徑跨度系數(shù)影響不顯著。Sila等利用內(nèi)源乳化法制備胰島素微膠囊,同樣得到了復(fù)配微膠囊粒徑和粒徑跨度系數(shù)均大于單一壁材微膠囊的實(shí)驗(yàn)結(jié)果¹³.

2.3微膠囊的機(jī)械強(qiáng)度

通過壓迫實(shí)驗(yàn),在旋轉(zhuǎn)流變儀上測定了各微膠囊在間距0.15mm處的法向應(yīng)力值,以此來表征微膠囊機(jī)械強(qiáng)度。如圖1所示,添加KGM后,所有 ALG-KGM微膠囊的機(jī)械強(qiáng)度比AG微膠囊都有所増加,而隨著KGM分子量的減小, ALG-KGM微膠囊機(jī)械強(qiáng)度呈現(xiàn)先增大后減小的變化規(guī)律,具體微膠囊機(jī)械強(qiáng)度排序如下:KGM-2>KGM-1>KGM-3>KGM-0>KGM-4>ALG。

2.4微膠囊的粘彈性

通過小振幅動(dòng)態(tài)掃描實(shí)驗(yàn),測定了微膠囊在角頻率0.1~100rad/s范圍內(nèi)的彈性儲(chǔ)能模量(G)和粘性損耗模量(G"),來表征微膠囊粘彈性。如圖2所示,對(duì)6種乳酸菌微膠囊而言,在角頻率掃描范圍內(nèi),G均大于G",同時(shí)G基本保持恒定,這是彈性體物質(zhì)的典型特征,也證明了本文中的微膠囊己凝膠化。為清晰比較6種乳酸菌微膠囊的粘彈性大小,特將w=1nad/s時(shí)的微膠囊G和G值做成表格,如表3所示。加入KG迅M后,復(fù)配微膠囊粘彈性均增大;而隨著KGM分子量的減小,ALG-KGM微膠囊的粘彈性呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢,這與 ALG-KGM微膠囊機(jī)械強(qiáng)度的變化趨勢相同.

2.5微膠囊的乳酸菌包埋率

表4中列出了各微膠囊乳酸菌包埋率,可以看出,添加KGM顯著提高了微膠囊的菌體包埋率。這可能與KGM的粘附性相關(guān),Wang等報(bào)道了向AIG添加KGM顯著提高了微膠囊中胰島素載藥量⁴,與本文結(jié)果相似。另外,KQM分子量也影響了 ALG-KGM微膠囊的菌體包埋效果,隨著KGM分子量減小,微膠囊菌體包埋率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。同樣地,Yang等以KGM水解物為壁材,通過乳化-噴霧干燥制備甜橙油微膠囊,研究發(fā)現(xiàn)中等粘度KGM水解物的包埋率高⁶。這可能是由于高分子量的KGM極大地增加了ALG溶膠粘度,不利于乳化液滴形成,低分子量的KGM失去了成膜能力,不能將乳酸菌有效包裹在微膠囊內(nèi).

表4乳酸菌微膠囊的包埋率

2.6 微膠囊模擬胃液菌體存貨率

如表5所示:通過微膠囊包埋,模擬胃液菌體存活率提高了10個(gè)數(shù)量級(jí),/在酸脅追條件下較好地保護(hù)了乳酸菌與AG微膠囊相比, ALG-KGM微膠囊模擬胃液菌體存活率都有一定程度的提高;KGM分子量影響了 ALG-KGM微膠囊的模擬胃液菌體存活率,隨著KGM分子量減小,微膠囊菌體包埋率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。由于機(jī)械強(qiáng)度是一項(xiàng)重要的微膠囊物理特性,故進(jìn)一步對(duì)微膠囊模擬胃液菌體存活率和機(jī)械強(qiáng)度進(jìn)行回歸分析。如圖3所示,通過Excel2007進(jìn)行一元線性回歸分析,得到微膠囊模擬胃液菌體存活率與機(jī)械強(qiáng)度的線性回歸方程為y=1.194x+3412,其中,相關(guān)系數(shù)R=0.96207R(0.05,4)0.81140,F49745,P0.002<005,表明該回歸方程顯著且微膠囊模擬胃液菌體存活率與機(jī)械強(qiáng)度正相關(guān)。與本文結(jié)果類似, Sandoval等報(bào)道了在酸奶和模擬胃液中,Lb.casei的存活率與微膠囊機(jī)械強(qiáng)度正相關(guān)¹⁴。這主要是由于微膠囊機(jī)械強(qiáng)度越大,結(jié)構(gòu)越緊實(shí),溶脹越小,微膠囊對(duì)乳酸菌的酸保護(hù)效果越好。

膽鹽是人體消化系統(tǒng)中的重要物質(zhì),具有抑菌性,故我們通過測定膽鹽菌體存活率來表征微膠囊對(duì)乳酸菌的保護(hù)作用。如表6所示:與自由菌相比,微膠囊膽鹽菌體存活率提高了10³個(gè)數(shù)量級(jí),說明微膠囊包埋可有效阻礙膽鹽對(duì)乳酸菌的傷害;與ALG微膠囊相比, ALG-KGM微膠囊膽鹽菌體存活率都有一定程度的提高;KGM分子量影響了 ALG-KGM微膠囊的膽鹽胃液菌體存活率,隨著KGM分子量減小,微膠囊菌體包埋率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。同樣地,我們對(duì)微膠囊膽鹽菌體存活率和機(jī)械強(qiáng)度進(jìn)行了回歸分析。如圖4所示,通過 Excel200進(jìn)行一元線性回歸分析,得到微膠囊膽鹽菌體存活率與機(jī)械強(qiáng)度的線性回歸方程為y=453×642,其中,相關(guān)系數(shù)R=096412R(005,4)0.81140,F=52752,P=0.02<005,表明該回歸方程顯著且微膠囊膽鹽菌體存活率與機(jī)械強(qiáng)度正相關(guān)。

綜合表5和表6中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們可以看出:1)在模擬胃液和膽鹽中,KGM與AIG復(fù)配后提高了微膠囊對(duì)乳酸菌的保護(hù)效果,這與Zou等人采用相冋內(nèi)源乳化法包埋乳酸菌的研究結(jié)果相同,這是由于復(fù)合壁材能填充海藻酸鈉凝膠的多孔結(jié)構(gòu),使海藻酸鈉結(jié)構(gòu)更結(jié)實(shí)、更穩(wěn)定;2)KGM分子量影響了AG-KGM微膠囊對(duì)乳酸菌的保護(hù)效果,這可能是由于不同分子量KGM與ALG相互作用方式不同造成的。如圖5所示,高分子ALG易于KGM發(fā)生相分離微膠囊機(jī)械強(qiáng)度較弱;低分子ALG片段狀存在,與AG相互作用較弱,微膠囊機(jī)械強(qiáng)度較弱;中等分子KGM,與AG相容性較好,可發(fā)生部分纏結(jié),從而具有較高的機(jī)械強(qiáng)度.

3結(jié)論

本研究以不同分子量的KGM與ALG復(fù)配,通過內(nèi)源乳化法制備乳酸菌微膠囊,表征了微膠囊粒徑特性、機(jī)械強(qiáng)度、粘彈性等物理特性,并測定了微膠囊的乳酸菌包埋率、模擬胃液菌體存活率、膽鹽菌體存活率等指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):ALG與KGM復(fù)配,增大了微膠囊粒徑、機(jī)械強(qiáng)度、粘彈性、乳酸菌包埋率、模擬胃液菌體存活率及膽鹽菌體存活率,提高了微膠囊對(duì)乳酸菌的保護(hù)效果;同時(shí),KGM分子量大小影響了 ALG-KGM微膠囊對(duì)乳酸菌的保護(hù)效果,其中中等分子量 KGM-ALG微膠囊具有高的乳酸菌包埋率、模擬胃液菌體存活率和膽鹽菌體存活率,這可能是與忑不同分子量KGM與ALG作用方式不同造成的.