細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法

細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等是腫瘤研究的重要表型，是分子生物學(xué)和藥理學(xué)研究解決的問題之一。通過在細(xì)胞中過表達(dá)或干擾某個(gè)基因研究基因?qū)?xì)胞增殖能力的影響，進(jìn)一步研究基因的功能，或?qū)?xì)胞進(jìn)行藥物處理，研究藥物對(duì)增殖的影響。

1. MTT法：是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。該方法已廣泛用于生物活性因子的活性檢測(cè)、抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等。它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)、快捷。

原理：活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。

2. CCK-8法:可用于簡(jiǎn)便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析，常用于藥物篩選、細(xì)胞增殖測(cè)定、細(xì)胞毒性測(cè)定、腫瘤藥敏試驗(yàn)。

原理：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-Methoxy PMS的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。

3. Brdu: 即5-Bromo-2'-Deoxyuridine,為胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期，S期活體注射或細(xì)胞培養(yǎng)加入。而后利用抗Brdu單克隆抗體ICC染色顯示增殖細(xì)胞。同時(shí)結(jié)合其它細(xì)胞標(biāo)記物雙重染色可判斷增殖細(xì)胞的種類，增殖速度，對(duì)研究細(xì)胞動(dòng)力學(xué)有重要意義。

但由于抗體分子量大，難于摻入并被有效檢測(cè)。因此BrdU檢測(cè)需采用DNA酶或HCl或加熱使DNA變性。這些處理方法會(huì)破壞抗原識(shí)別位點(diǎn)，此外許多細(xì)胞周期分析的染料都需要dsDNA。這種處理方法也使得同一樣本無法同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞周期分析。對(duì)于植物細(xì)胞等有細(xì)胞壁的分析。采用抗體檢測(cè)還需要消化細(xì)胞壁，細(xì)胞壁消化酶常含有一些雜質(zhì)，會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)的可靠性降低，同時(shí)BrdU檢測(cè)則需要進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的孵育--幾個(gè)小時(shí)甚至過夜。

4. EDU: 即5-Ethynyl-2’- deoxyuridine, 是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖時(shí)期代替胸腺嘧啶（T）滲入正在復(fù)制的DNA分子中。通過基于EdU與Apollo熒光染料的特異性反應(yīng)快速檢測(cè)細(xì)胞DNA復(fù)制活性，適用于細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、生長(zhǎng)與發(fā)育、DNA修復(fù)、病毒復(fù)制、細(xì)胞標(biāo)記示蹤等方面的研究，尤其適合進(jìn)行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他藥物的篩選實(shí)驗(yàn)。