目錄:上海帛科生物技術(shù)有限公司>>生化檢測(cè)試劑盒>>氧化與抗氧化系列>> 線粒體活性氧產(chǎn)生速率（ROS）測(cè)試盒熒光法
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更新時(shí)間：2023-12-28 20:27:38瀏覽次數(shù)：539評(píng)價(jià)
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| 貨號(hào) | BK-01S6410 |
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實(shí)驗(yàn)方法學(xué)：
一、肝素的配制：
市售肝素凍干粉140單位/mg，1克瓶裝，每瓶140，000單位，稱取0.1克肝素凍干粉，加生理鹽水5ml，配成2800單位/ml。取50～100μl濕潤(rùn)管壁，可抗凝人血3～5ml，血液不會(huì)凝固。老鼠血易凝固，所以最好更濃一些?？梢匀?.1克肝素凍干粉，加3ml生理鹽水溶解后，取50～100μl,可抗凝鼠血2～4ml。
肝素抗凝管的制備：取0.1克肝素凍干粉，加2.5ml生理鹽水。取100μl～150μl滴入塑料或玻璃管中，濕潤(rùn)管壁，低于80℃小烤箱中（可以用烤面包的小烤箱），橫向轉(zhuǎn)動(dòng)，每隔5～10分鐘轉(zhuǎn)動(dòng)一次，直至干燥后放入4℃保存，可使2～5ml血液不凝固。
二、血液樣本的收集：
全血根據(jù)收集的條件，分成不抗凝和抗凝兩種。同時(shí)，不抗凝分離出的上層黃色的液體我們稱之為血清；抗凝分離出的上層黃色的液體我們稱之為血漿。
1、不抗凝收集血清:將收集好的全血,靜置1～2小時(shí)，直接低速離心分離出血清待用或保存。
2、抗凝收集血漿: 收集抗凝全血，輕輕顛倒充分抗凝后，可直接低速離心分離血漿(也可靜置半小時(shí)左右再低速離心分離血漿)待用或保存。根據(jù)不同抗凝劑的性能特征，選擇合適的抗凝劑。實(shí)驗(yàn)室常用的抗凝劑有肝素的各種鹽、EDTA及。
選擇抗凝的注意點(diǎn)：
①、每一份樣本所加的抗凝劑的量要一致，同時(shí)所取的全血的量也要盡量一致;
②、收集抗凝全血后一定要輕輕顛倒，充分抗凝，防止部分血液未接觸到抗凝劑而導(dǎo)致凝固;
③、抗凝全血收集的血漿相對(duì)較多（1ml抗凝全血能分離出0.4～0.5ml血漿）;
④、抗凝收集的血漿冷凍保存后，解凍時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀渾濁，如有則需要離心去掉渾濁后
用于測(cè)定。
特別提醒：本產(chǎn)品僅供科研研究使用，不得用于人體臨床直接檢測(cè)。
產(chǎn)品名稱：線粒體活性氧產(chǎn)生速率（ROS）測(cè)試盒熒光法
產(chǎn)品規(guī)格：100管/96樣
檢測(cè)方法：熒光法
產(chǎn)品貨號(hào)：BK-01S6410
產(chǎn)品分類：氧化與抗氧化系列
商品介紹：
測(cè)定意義: 活性氧(Reactive oxygen species, ROS)包括超氧自由基、過氧化氫、及其下游產(chǎn)物過氧化物和羥化物等，研究表明，機(jī)體95％以上的活性氧（ROS）都來自于線粒體，其失衡所致的氧化應(yīng)激與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程有關(guān)。 正常情況下，細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)與氧自由基處于平衡狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平維持在較低的生理范圍；在病理情況下，細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)與氧自由基的平衡被打破，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平過多，就可破壞線粒體酶類、脂類和核酸，使機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激，同時(shí)，活性氧還可攻擊線粒體DNA產(chǎn)生氧化損傷，導(dǎo)致線粒體ATP合成減少、線粒體膜電位破壞等結(jié)構(gòu)和功能變化。 因此，通過檢測(cè)活性氧的變化來判斷線粒體的功能是否正常具有重要意義。 測(cè)定原理： 熒光探針-還原型二氯熒光素 (2', 7'-dichlorodihy drofluorescin diacetate, DCFH-DA)可擴(kuò)散通過線粒體膜，在線粒體內(nèi)被酯酶水解，形成無熒光的DCFH，DCFH迅速與ROS反應(yīng)生成熒光物—氧化型二氯熒光素(2', 7'-dichlo rofluorescin, DCF)。 根據(jù)上述原理設(shè)計(jì)了利用熒光法直接定量檢測(cè)線粒體ROS產(chǎn)生速率的方法。將熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的數(shù)據(jù)點(diǎn)擬合，線性回歸直線斜率與ROS產(chǎn)生的速率呈正比。 需自備的儀器和用品： 多功能酶標(biāo)儀、恒溫培養(yǎng)箱、分析天平、可調(diào)式移液器、冰、蒸餾水。 |
所需的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、低溫離心機(jī)、移液器、研缽、冰和蒸餾水
四、超氧化物歧化酶（SOD）的測(cè)定：
建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn)
樣本和試劑浪費(fèi)！
1、樣本制備
① 組織樣本： 取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.25g），加入 1mL 提取液，在 4oC 或冰浴進(jìn)行 勻漿(或使用各類常見勻漿器)。4oC×12000rpm 離心 10min，取上清作為待測(cè)液。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取
| ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本： 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（10 4）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本：直接檢測(cè)；若渾濁，離心后取上清檢測(cè)。 |
注意事項(xiàng)：
1、試劑二為酶，不可冷凍，使用時(shí)在冰上放置。
2、對(duì)照管只需要做一管。
3、若對(duì)照管吸光值大于2，建議將試劑二用蒸餾水稀釋7倍后使用（10μl試劑二原液+60μl蒸餾水）。
4、SOD為什么有的樣本測(cè)定管大于對(duì)照管，對(duì)照管數(shù)值在什么范圍？
對(duì)照管的范圍是0.8-2。對(duì)照管吸光值過低可能是（1）試劑二或試劑四沒有現(xiàn)配現(xiàn)用；（2)沒有按順序加試劑；（3）反應(yīng)時(shí)間不夠，可以延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間（反應(yīng)時(shí)間30min可以延長(zhǎng)到40min）。對(duì)照管吸光值過高可能是試劑二未按操作說明書稀釋相應(yīng)倍數(shù)。
若出現(xiàn)測(cè)定管大于對(duì)照管，可能是樣本中雜質(zhì)的影響太大，為了降低雜質(zhì)的影響一般將樣本提取上清液用蒸餾水或提取液稀釋10倍后再測(cè)，通?？梢允箿y(cè)定正常。計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
100mL PEG-TE-LiAc Solution PEG-TE-LiAc Solution 常溫保存
0.1mL×10 SURE化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞 SURE Competent Cell -80℃保存
2 ug pNTAP- A pNTAP- A 低溫運(yùn)輸，-20℃保存
B5培養(yǎng)基（不含瓊脂和蔗糖） B5 Medium(without agar or sucrose) 250g
2 ug pC-YFP pC-YFP 低溫運(yùn)輸，-20℃保存
100U PreScissiom 蛋白 PreScissiom Protease -20℃保存
2 ug p53Blue p53Blue 低溫運(yùn)輸，-20℃保存
萘啶酮酸(4.0mg) Nalidixic Acid 4.0mg*5
1g Xanthine 室溫干燥保存
1000支 0.5 mL RNase-free 離心管 常溫
50 T 過氧化氫測(cè)試盒 Oxidative Stress Detection Kit 常溫保存
線粒體活性氧產(chǎn)生速率（ROS）測(cè)試盒熒光法Hemopexin/HPX 糖蛋白β-1B抗體 規(guī)格: 0.1mlRNF35 環(huán)指蛋白35抗體 規(guī)格: 0.2ml
Rabbit Anti-chicken IgM/Cy3 Cy3標(biāo)記的兔抗雞IgM 規(guī)格: 0.1mlCatalase 過氧化抗體 規(guī)格: 0.2ml
ADAMTS2 整合素樣金屬蛋白與凝2型抗體 0.2mlfactor XIII 凝因子13抗體(纖維蛋白穩(wěn)定因子) 規(guī)格: 0.2ml
Transferrin(1F10) 轉(zhuǎn)鐵蛋白單克隆抗體 規(guī)格: 0.1ml
SERPINB12 絲蛋白抑制劑B12抗體 規(guī)格: 0.2ml
Granzyme D/B/E/N/G/F/H 顆粒D/B/E/N/G/F/H抗體 規(guī)格: 0.1ml
Emerin Emerin蛋白抗體 規(guī)格: 0.1ml
WIG-1/PAG608 野生型P53誘導(dǎo)基因1抗體 0.1ml
APLP2 淀粉樣蛋白β前體樣蛋白2抗體 規(guī)格: 0.2ml
MDR1/p-GP/CD243 (C-terminus) 多藥耐藥蛋白/P-糖蛋白抗體(C端) 規(guī)格: 0.1ml
TSP50 瘤/睪抗原20抗體 規(guī)格: 0.2ml
Phospho-Histone H2A.X (Tyr143) 磷酸化組蛋白H2AX抗體 規(guī)格: 0.1ml
(空格分隔,最多3個(gè),單個(gè)標(biāo)簽最多10個(gè)字符)
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