一、 原理 

本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)等樣本中的喹乙醇，在微孔條上預(yù)包被上偶聯(lián)抗原，利用抗原與抗體的特異性免疫化學(xué)反應(yīng)的原理來進(jìn)行的，樣本中的喹乙醇和微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗喹乙醇抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣品中的喹乙醇含量與樣品的吸光度值呈反比，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出喹乙醇含量。

二、 試劑盒技術(shù)指標(biāo)：

試劑盒靈敏度：  1ppb

樣本檢測(cè)下限：

組    織—————————————1ppb

飼    料————————————100ppb

交叉反應(yīng)率：

喹乙醇 ———————————————  100%

卡巴多 ——————————————  ﹤7%

回收率：

組   織————————————80%±10%

飼   料————————————80%±15%

三、試劑盒組成

1、    微量測(cè)試孔：每條8孔，一板12條

2、    標(biāo)準(zhǔn)溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、1ppb、3ppb、9ppb、27ppb、81ppb

3、    酶標(biāo)記物  12ml  ………………紅色帽

4、    抗體工作液 7ml  ……………… 藍(lán)色帽

5、    底物A液   7 ml…………………白色帽

6、    底物B液   7 ml…………………黑色帽

7、    終止液     7 ml…………………黃色帽

8、    20X濃縮洗滌液40 ml……………白色帽

9、    2X濃縮復(fù)溶液  50 ml……………透明帽

四、 所用儀器、試劑

具備的儀器：微孔酶標(biāo)儀、氮?dú)獯蹈裳b置、打印機(jī)、均質(zhì)器 、振蕩器、離心機(jī)、恒溫箱、天平（感量0.01g）、刻度移液管

微量移液器：?jiǎn)蔚?/span>20µl-200µl、100µl-1000µl、多道250µl

試     劑：乙腈、正己烷

五、樣本前處理步驟

樣本處理前須知

處理任何樣本時(shí)，都必須注意：

（a）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。

（b）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必要時(shí)可對(duì)實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

（a）組織（豬肝、豬肉、魚、蝦等）樣本的處理方法

1、    稱2±0.05g組織，加入10ml無水乙腈，振蕩5min,室溫4000r/min以上離心10min。

2、    取上清液5ml于50℃氮?dú)饣蚩諝庀?/span>吹干。

3、    用2ml正己烷溶解干燥物，用1ml已稀釋

好的復(fù)溶液（2X濃縮復(fù)溶液與去離子水1:1

稀釋）充分混合30s；4000r/min以上

離心5min。

4、    取50µl進(jìn)行分析。

樣本稀釋倍數(shù)：1

（b）飼料樣品的處理方法

1、    將飼料樣品研碎，稱1.0±0.05g研碎的飼料

樣品，加入2g Al₂O₃ ，然后加入5ml乙腈，

劇烈震蕩2min，室溫避光靜置8min，取出

上清液50ul與已稀釋好的復(fù)溶液950ul （2X

濃縮復(fù)溶液與去離子水1:1稀釋），混勻，

25℃，4000r/min,；離心5min。

2、    取50ul上清進(jìn)行分析。

樣本稀釋倍數(shù):100

六、酶標(biāo)免疫分析程序

1、    將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、    按需要取出微孔條及板架，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、    配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

4、    編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

5、    加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl/孔到各自的微孔中，再加入50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜蓋板，輕輕振蕩混勻，37℃環(huán)境反應(yīng)30min 。

6、    取出微孔板，甩出孔內(nèi)液體，用洗滌液按250μl /孔洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，用吸水紙拍干.

7、    酶標(biāo)記物：加入酶標(biāo)記物100µl/孔，用蓋板膜封板，37℃環(huán)境中反應(yīng)30min。取出酶標(biāo)板，如前述洗板5次。

8、    顯色：每孔先加入底物液A液50µl，再加B液50µl，輕輕振蕩混勻，37℃環(huán)境中避光顯色15min。

9、    測(cè)定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測(cè)定吸光度值（OD值）。

七、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含喹乙醇的含量成負(fù)相關(guān)。

1、    粗略判定：

用樣品的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出樣本所含喹乙醇濃度范圍（ng/ml）。假設(shè)樣品1的吸光度值為0.313，樣品2的吸光度值為1.032，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為1.892；1ppb為1.501；3ppb為1.175； 9ppb為0.751； 27ppb為0.421； 81ppb為0.198。則樣品1的濃度范圍是27ppb-81ppb；樣品2的濃度范圍是3ppb-9ppb。乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中喹乙醇實(shí)際濃度。

2、  定量分析：

所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中喹乙醇實(shí)際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣品的準(zhǔn)確、快速分析。

八、注意事項(xiàng)

1、    用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。

2、    用之后立即將所有試劑放回2-8℃冰箱。

3、    在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，仔細(xì)按照推薦的洗板順序操作是ELISA測(cè)定程序中的要點(diǎn)。

4、    所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。

5、    室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本沒有回到室溫（20-25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

6、    在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

7、    混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

8、    反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

9、    不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號(hào)的盒中試劑。

10、不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

11、顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

12、該試劑盒*反應(yīng)溫度為37℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九、儲(chǔ)藏條件和保質(zhì)期

儲(chǔ)藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。

保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。

提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，請(qǐng)放心使用。