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即用型SP-A免疫組化染色試劑盒

大鼠IgG 使用說明書

產(chǎn)品編號：QD82105

試劑的保存：短期于4℃保存，長期于-20℃保存。

工作原理

肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A(pulmonary surfactant-associated protein A,SP-A)是肺表面活性物質(zhì)(pulmonary sur-factant,PS)中含量zui豐富的蛋白成分,主要分布于支氣管表面和肺泡氣液界面上,屬C-型膠凝素家族的重要成員,在維持PS的正常生物學(xué)功能和調(diào)節(jié)局部免疫及炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用。

S-Avidin(鏈霉親和素)是一種從鏈霉菌中提取的蛋白質(zhì)，分子量47000。同親和素一樣，對生物素分子有*的親和力，是一般抗原抗體親和力的一百萬倍。親和素是一個堿性蛋白質(zhì)（IP=10），經(jīng)改造后可以轉(zhuǎn)變成中性蛋白質(zhì)。鏈霉親和素等電點接近中性，IP=6.0~6.5，對組織和細(xì)胞的非特異吸附很低，基于鏈霉親和素的免疫組化方法背景很低。SABC即 StreptAvidin—Biotin  Complex,。根據(jù)研究，SABC大約可形成上百個左右的過氧化物酶和數(shù)十個左右的鏈霉親和素所構(gòu)成的復(fù)合物。SABC兼具高敏感性，低背景和操作簡便的優(yōu)點。

應(yīng)用范圍

適用于免疫組織化學(xué)方法以顯示待測抗原的分布，本試劑盒適用于常規(guī)石蠟包埋切片、冰凍切片，培養(yǎng)固定的細(xì)胞切片以及新鮮制備的血涂片、爬片等。

試劑盒中內(nèi)容

1. 山羊血清封閉液：1ml(效價1：10，臨用前用TBS或PBS稀釋10倍)。用于組織切片的封閉。
2. 二抗：1ml（效價1：10，臨用前用抗體稀釋液稀釋10倍)。親和純化抗體，標(biāo)記長臂生物素，生物素標(biāo)記抗大鼠IgG。
3. SABC：1ml（效價1：10，臨用前用SABC稀釋液稀釋10倍）。鏈酶親和素-過氧化物酶復(fù)合物。

用戶自備試劑：

1. 粘片劑APES或Poly-L-Lysine。
2. 0.01M PBS，0.01M 枸櫞酸鹽緩沖液。
3. DAB顯色試劑盒。
4. 免疫組化染色程序的選擇：

用戶需根據(jù)抗原/抗體的特點確定程序，多數(shù)情況下要先比較各程序染色結(jié)果。

石蠟切片染色程序:

1. 載玻片防脫片劑處理:可選擇APES或Poly-Lysine。撈片后置烤箱58-60 ℃30-60分以使切片緊密粘附。
2. 切片常規(guī)脫蠟至水。
3. 3%H2O2 1份+蒸餾水10份混合,室溫5-10分鐘以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。
4. 酶消化程序:滴加復(fù)合消化液5-10分鐘。蒸餾水洗3次。也可以使用0.1%的胰蛋白酶作消化液。熱修復(fù)抗原:將切片浸入0.01M  枸櫞酸鹽緩沖液（PH6.0）,電爐或微波爐加熱至沸騰  后斷電，間隔5-10分鐘后，反復(fù)1-2次。冷卻后PBS（pH7.2-7.6）洗滌1-2次。
5. 滴加封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體, 不洗。
6. 適當(dāng)稀釋的一抗（大鼠IgG），37 ℃ 2小時左右或4℃過夜。PBS（pH7.2-7.6）洗2分鐘×3次。（一抗的稀釋度、孵育時間和溫度與染色強(qiáng)度、背景有直接關(guān)系。一般來說，陽性染色強(qiáng)度不夠時，可提高一抗?jié)舛群脱娱L孵育時間；背景過高時，可降低一抗?jié)舛群涂s短孵育時間。）
7. 加生物素化抗大鼠IgG,37℃ 30分鐘。PBS（pH7.2-7.6）洗2分鐘×3次。
8. 滴加試劑SABC,3 7℃ 30分鐘。PBS（pH7.2-7.6）洗5分鐘×4次。
9. DAB顯色:使用DAB顯色試劑盒。取1ml蒸餾水,加試劑盒中A,B,C試劑各50ul,混勻后加至切片。室溫顯色, 顯微鏡下觀察顯色反應(yīng)，時間一般在5-30分鐘之間。達(dá)到合適著色強(qiáng)度時（陽性較強(qiáng)，背景較低），即可終止反應(yīng)（用蒸餾水洗滌切片）。
10. 蘇木素輕度復(fù)染。脫水,透明,封片。顯微鏡觀察。

注意事項：

1. 如果染色背景過高，在SABC反應(yīng)之后，DAB顯色之前,用加有0.01—0.02% TWEEN20的PBS（pH7.2-7.6）洗滌切片4次，單純PBS洗2次，然后DAB顯色。警告：DAB 為可疑致癌物，請采取必要的防范措施。
2. 熱修復(fù)抗原可選0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（PH6.0）；也可以使用PBS、TBS等多種緩沖液。
3. 脫蠟不*，容易出現(xiàn)非特異性背景染色，建議免疫組化切片脫蠟與常規(guī)H.E脫蠟分開。
4. 如果將本試劑盒用于肝臟與腎臟等含內(nèi)源性生物素含量豐富的組織切片，需要進(jìn)行封閉的特殊處理。
5. 在超過有效期的試劑盒中一種或多種試劑活性可能降低，因此不得使用過期的試劑盒，不同批號間的試劑盒也不能交叉混用。