Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 細胞增殖與活性檢測試劑盒是百螢生物生產(chǎn)的一種基于 WST-8 的廣泛應(yīng)用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。百螢生物是 AAT Bioquest 中國區(qū)域一級代理商，為國內(nèi)提供 AAT 的原裝產(chǎn)品及產(chǎn)品定制、技術(shù)服務(wù)，歡迎咨詢、訂購！

實驗方案

1.在96 孔板中配置100μL的細胞懸液（通常細胞增殖實驗每孔加入100μL2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100μL5000個細胞。具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等因素決定)。按照實驗需要，進行培養(yǎng)（在37°C，5%CO2的條件下）預(yù)培養(yǎng)24 小時。

2.向培養(yǎng)板加入1-10μL 不同濃度的待測藥物刺激。

3.將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r間（例如：6、12、24 或48 小時）。

4.每孔加入10μLCCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD 值的讀數(shù)）。如果起始的培養(yǎng)體積為200μL，則需加入20μLCCK-8溶液，其它情況以此類推。可以用加了相應(yīng)量細胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作為空白對照。如果擔(dān)心所使用的藥物會干擾檢測，需設(shè)置加了相應(yīng)量細胞培養(yǎng)液、藥物和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作為空白對照。

5.在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1-4小時，對于大多數(shù)情況孵育1小時就可以了。時間的長短根據(jù)細胞的類型和細胞的密度等實驗情況而定，初次實驗時可以在0.5、1、2和4小時后分別用酶標儀檢測，然后選取吸光度范圍比較適宜的一個時間點用于后續(xù)實驗。

6.用酶標儀測定在450nm處的吸光度，如無450nm濾光片，可以使用420-480nm的濾光片?？梢允褂么笥?00nm的波長，例如650nm，作為參考波長進行雙波長測定。

7.如果暫時不測定OD 值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10 μL 0.1M 的HCL 溶液或者1% w/v SDS 溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。

注意：如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK 之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。

注意事項：

1.由于使用96孔板進行檢測，如果細胞培養(yǎng)時間較長，一定要注意蒸發(fā)的問題。一方面，由于96孔板周圍一圈容易蒸發(fā)，可以采取棄用周圍一圈的辦法，改加PBS，水或培養(yǎng)液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培養(yǎng)箱內(nèi)水源的地方，以緩解蒸發(fā)。

2.CCK-8檢測細胞活性的原理是通過檢測活細胞脫氫酶催化的反應(yīng)。任何待測體系中存在還原劑，例如一些抗氧化劑會干擾檢測，需設(shè)法去除。

3.建議先做幾個孔摸索接種細胞的數(shù)量和加入CCK-8試劑后的培養(yǎng)時間。

4.建議采用多通道移液器，可以減少平行孔間的差異。加入CCK 試劑時，建議斜貼著培養(yǎng)板壁加，不要插到培養(yǎng)基液面下加樣，容易產(chǎn)生氣泡，會干擾OD 值讀數(shù)。

5.當(dāng)使用標準96 孔板時，貼壁細胞的小接種量至少為1,000 個/孔 (100 μL培養(yǎng)基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500 個/孔 (100 μL培養(yǎng)基)，且培養(yǎng)時間長一些。如果要使用24 孔板或6 孔板實驗，請先計算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液。

6.加入CCK -8溶液時，如果細胞培養(yǎng)時間較長，培養(yǎng)基顏色已變化或pH值變化。建議換用新鮮的培養(yǎng)基。

7.如果沒有450nm 的濾光片，可以使用吸光度在430-490 nm 之間的濾光片，但是450nm 濾光片的檢測靈敏度最高。

8.酚紅和血清對本試劑盒的測定無明顯影響。培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。

9.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

實驗圖：

圖 2. CCK-8 檢測細胞活性原理圖

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