兩個大生物分子間的共價結(jié)合，是研究人員的一項重要任務(wù)，例如酶的抗體或DNA的酶。有多種可用于交聯(lián)兩種生物分子的方法，其中常見的方法，就是使用小交聯(lián)劑（如磺化SMCC）。SMCC一端具有胺反應(yīng)的NHS脂與蛋白質(zhì)的游離胺（-NH2）反應(yīng)，另一端具有巰基反應(yīng)的馬來酰亞胺基與生物分子的巰基（-SH）反應(yīng)。SMCC修飾的蛋白質(zhì)接頭是非常不穩(wěn)定的，通常是自反應(yīng)的，因為蛋白質(zhì)通常含有游離胺和巰基，導(dǎo)致大量的同位交聯(lián)。另外，蛋白質(zhì)上馬來酰亞胺基團數(shù)目的定量是繁瑣的，而且很難確定兩個生物分子在反應(yīng)中聯(lián)接的合適的摩爾比以達到理想的功能和偶聯(lián)效率。

現(xiàn)在，有一種簡單有效的交聯(lián)方法，將兩個高共軛率的生物分子連接起來。該方法使用兩種特別的交聯(lián)劑（Buccutite MAT和Buccutite FOL）。MAT和FOL蛋白的交聯(lián)劑易于控制和量化。經(jīng)過脫鹽柱去除游離連接物后，Buccutite MAT激活的抗體和Buccutite FOL修飾的蛋白質(zhì)在溫和條件下混合后易發(fā)生反應(yīng)。從本質(zhì)上講，這種純化是不必要的，而且在反應(yīng)中沒有同位交聯(lián)的生物分子。

使用Buccutite MAT和Buccutite FOL的交聯(lián)方法

材料和方法

抗體和酶：山羊抗小鼠lgG和小鼠lgG來自Jacksonm免疫研究實驗室，HRP來自Calzyme，微管蛋白小鼠mAb來自Life Technologies.

凈化柱：所有的凈化柱都來自Bio-Rad的Bio-Spin尺寸排除柱。

細(xì)胞成像：Hela細(xì)胞用4%甲醛固定，用小鼠抗微管蛋白染色，然后用HPR-Goat-Anti-Mouse lgG綴合物染色。用Olympus IX71熒光顯微鏡成像。

共軛原理

1.用MAT激活山羊抗小鼠lgG，用FOL（1小時）修飾標(biāo)簽蛋白（APC或PE）。

2.用旋轉(zhuǎn)柱（5min）對激活的lgG5和修飾的標(biāo)記蛋白進行純化。

3.將活化的抗體和修飾的標(biāo)記蛋白混合30分鐘。

4.用所需的共軛物染色細(xì)胞，無需純化。

抗體蛋白質(zhì)結(jié)合過程

結(jié) 果

用于ELISA檢測的HRP-lgG共軛物

用Buccutite交聯(lián)技術(shù)（紅色）和SMCC方法（藍(lán)色）制備HPR-山羊-抗小鼠lgG共軛物，產(chǎn)生直接ELISA曲線。將小鼠單克隆抗體（100ng）包被在96孔板上，用標(biāo)準(zhǔn)方法將GAM lgG-HRP共軛物稀釋為2倍稀釋系列。使用ABTS底物溶液（#11001）檢測30分鐘并在405nm讀取的固定化小鼠lgG.