百螢問號：Western Blot實驗中常見問題解答

時間：2024/3/25閱讀：130

Western 免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測的實驗。在WB 實驗中常會出現(xiàn)各種問題，而拖慢實驗速度，使實驗達不到理想的效果。今天百螢跟各位同學一起分享下 WB 實驗中各種問題及問題建議。

常見問題	可能原因	建議
電泳條帶成笑臉狀	膠不均勻冷切，中間冷卻不好，電泳系統(tǒng)溫度偏高	減少電壓減慢電泳速度，在冷室或者冰浴中進行電泳
電泳條帶成皺眉狀	可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不w全	調整裝置
拖尾	樣品溶解不好	樣品充分溶解混勻后上樣
紋理(縱向條紋)	樣品中含有不溶性顆粒	樣品充分攪拌混勻
條帶偏斜	電極不平衡或者加樣位置偏斜	調整電極和加樣
條帶兩邊擴散	加樣量過多	適當減少上樣量
Marker 變黑色	抗體和 Marker 蛋白反應	在 Marker 和 sample 之間空出一個孔不上樣
背景高	膜封閉不夠	延長封閉時間，選擇適宜的抗體稀釋度
	一抗稀釋度不適宜	對抗體進行滴度測試，選擇適宜的抗體稀釋度
	一抗孵育的溫度偏高	建議 4℃ 結合過夜
	二抗?jié)舛榷冗^高	降低二抗?jié)舛?/span>
	二抗的非特異性背景	增加一個二抗對照，不加一抗，其他操作過程不變，即可驗證背景是否是由于二抗所致。可選擇其它二抗（特異性更強的，只針對重鏈）
	二抗孵育時間過久	減少二抗孵育時間
	選擇膜的問題	硝酸纖維素的背景會比 PVDF 膜低
	膜在實驗過程中干過	實驗過程中要注意保持膜的濕潤
	檢測時曝光時間過長	注意曝光時間的縮短
	洗膜不充分	增加洗膜的時間和次數
	抗體和封閉蛋白有交叉反應	檢測抗體與封閉蛋白的交叉反應性，選擇無交叉反應的封閉劑。洗滌液中加入 Tween-20 可減少交叉反應
雜帶較多	目的蛋白有多個修飾位點（磷酸化位點，糖基化位點，乙?；稽c等），本身可以呈現(xiàn)多條帶	查閱文獻或進行生物信息學分析，獲得蛋白序列的修飾位點信息，通過去修飾確定蛋白試劑大小
	目的蛋白有其他剪切本	查閱文獻或生物信息學分析可能性
	樣品處理過程中目的蛋白發(fā)生降解	裂解液中加入蛋白酶抑制劑，樣品處理在冰上進行
	上樣量過高，太敏感	適當減少上樣量
	一抗不純	純化抗體
	一抗特異性不高	重新選擇或制備高特異性的抗體
	二抗的非特異性結合	增加一個二抗對照，不加一抗，其他操作過程不變，即可驗證背景是否是由于二抗所致?？蛇x擇其它二抗（特異性更強的，只針對重鏈）
	一抗或二抗?jié)舛绕?/span>	降低抗體濃度
	細胞傳代較多，導致蛋白變異	使用原代或傳代少的細胞作對照
蛋白條帶位置（大?。┎粚?/span>	二聚體或多聚體存在	增加蛋白質變性過程及強度
	翻譯后剪切	比如很多蛋白是以前體蛋白的形式合成的，在執(zhí)行功能時需要進行剪切成活化的形式
	相對電荷	氨基酸電荷的組成
	蛋白修飾	比如糖基化、磷酸化等修飾狀態(tài)會導致蛋白分子量增加
	膠濃度	不同濃度的膠跑出的蛋白條帶的位置可能有所偏差
無蛋白條帶	抗體孵育不充分	增加抗體濃度，延長孵育時間
	酶失活	直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯(lián)物
	標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低	設置陽性對照，如果陽性對照有結果，但標本沒有則可能是標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考慮增加標本上樣量解決靶蛋白含量低的原因
	試劑之間不匹配	一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間不匹配。通過設置內參照可以驗證二級檢測系統(tǒng)的有效性
	一抗失效	選擇在有效期內抗體，幷選擇現(xiàn)配現(xiàn)用的工作液
	HRP 抑制劑	所用溶液和容器內避免含有疊D化鈉
	抗體不能識別測試種屬的相關蛋白	購買抗體前應認真閱讀抗體說明書，確定其是否能夠交叉識別測試種屬的對應蛋白
	二抗與一抗不匹配	選擇針對一抗來源種屬的抗體
蛋白條帶信號弱	抗體孵育不充分	增加抗體濃度，延長孵育時間
	酶活性降低	直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯(lián)物
	洗膜過度	洗膜時間不宜過長，加入的去垢劑不宜過強或過多，建議使用 0.1% 的弱去垢劑 Tween-20
	標本中靶蛋白含量太低	增加樣本上樣量
	抗體活性降低	選擇有效期內的抗體，工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，避免長時間放置
	蛋白轉移不充分	可以用麗春紅染膜幷結合染膠（考馬斯藍）后確定條帶是否轉移到膜上或轉移過度，適當調整轉膜的時間和電流
	封閉過度	減少封閉劑的量或縮短時間，換用不同封閉劑類型
	曝光時間過短	延長曝光時間
	HRP 抑制劑	所用溶液和容器內避免含有疊D化鈉
背景有黑色斑點	抗體與封閉試劑反應	使用前過濾封閉試劑
背景有黑色斑點	HRP 偶聯(lián)二抗中有聚集體	過濾二抗試劑，去除聚集體
暗背景上白色帶	HRP 含量過高	降低酶聯(lián)二抗的濃度
背景有不均勻的白色斑點	轉膜過程中有氣泡存在	仔細檢測，避免存在氣泡
背景有不均勻的白色斑點	抗體分布不均勻	孵育抗體時使用搖床

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