Amplite 比色法鞘磷脂酶檢測試劑盒 藍色熒光是美國AAT Bioquest生產(chǎn)的用于檢測鞘磷脂的試劑盒，鞘磷脂酶（SMase）是一種酶，負責將鞘磷脂（SM）切割成磷酸*堿和神經(jīng)酰胺。細胞中SMase的在細胞反應中起重要作用。已經(jīng)基于它們的陽離子依賴性和佳作用pH鑒定了五種類型的鞘磷脂酶（SMase）。它們是溶酶體酸性SMase，分泌鋅依賴性酸性SMase，鎂依賴性中性SMase，鎂依賴性中性SMase和堿性SMase。在這五種類型中，溶酶體酸性SMase和鎂依賴性中性SMase被認為是細胞對應激反應中產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的主要候選物。

我們的Amplite 比色鞘磷脂酶檢測試劑盒為檢測中性SMase活性或篩選其抑制劑提供了一種靈敏的方法。 該試劑盒使用我們專有的Amplite Blue作為比色探針，間接定量鞘磷脂酶（SMase）水解鞘磷脂（SM）產(chǎn)生的磷酸*堿。它可用于測量血液，細胞提取物或其他溶液中的SMase活性。655nm處的光吸收與磷酸*堿的形成成比例，因此與SMase活性成比例。該試劑盒是一種優(yōu)化的“混合和讀數(shù)"分析，與HTS液體處理儀器兼容。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的Amplite 比色法鞘磷脂酶檢測試劑盒 。

實驗方案

96孔板測定示例

概述

準備鞘磷脂工作溶液（50μL）

添加SMase標準品和/或SMase測試樣品（50μL）

在37°C孵育1-2小時

加入鞘磷脂酶工作溶液（50μL）

在室溫下孵育持續(xù)1-2小時

監(jiān)測655nm處的吸光度

注意：在開始實驗之前，在室溫下解凍每個試劑盒組分的一個小瓶（或瓶）。

溶液配制

1.儲備溶液配制

1.1鞘磷脂酰*堿酶標準儲備溶液（10 U/mL）：

將含有0.1%BSA的20µL PBS加入鞘磷脂酶標準品（組分F）瓶中，制成10units/mL鞘磷脂酶的標準儲備溶液。

1.2Amplite™ UltraBlue儲備溶液（200X）：

向Amplite™UltraBlue ( C組分)瓶中加入100 μ L DMSO ( G組分)，制成200 × Amplite™UltraBlue儲備液。注：Amplite™Ultra Blue在硫醇(如DTT和2 -巰基乙醇等)存在下不穩(wěn)定。反應中DTT或2 -巰基乙醇的終濃度應低于10 µ M，Amplite™Ultra Blue在高pH ( > 8.5 )下也不穩(wěn)定。反應應在p H 7 ~ 8之間進行。

2.標準溶液配制

將1 µ L的10units/ mL的鞘磷脂酶標準儲備液加入1000 µ L的檢測緩沖液( E組分)中，生成10 mU / mL的鞘磷脂酶標準品。取10 m U / m L鞘磷脂酶標準品500 µ L，進行1∶2系列稀釋，得到系列稀釋的鞘磷脂酶標準品( SMase7 - SMase1)。注：稀釋后的鞘磷脂酶標準儲備液不穩(wěn)定，應在4小時內(nèi)使用。

3.工作溶液配制

3.1.準備鞘磷脂工作液：

將50μL鞘磷脂（組分B）加入5mL SMase反應緩沖液（組分D）中，并充分混合。

注意：應及時使用鞘磷脂工作液。

3.2.鞘磷脂酰*堿酶工作溶液：

在酶混合液(組分A )瓶中加入5 m L Assay Buffer (組分E )，混勻。在酶標混合液瓶中加入50 μ L 200X Amplite™Ultra Blue儲備液，開始測定。注意：應及時使用鞘磷脂酶工作液，注意避光；較長時間的儲存容易造成較高的檢測背景?；旌衔锏臏啙岫日＃徊粫z測性能產(chǎn)生干擾。