96孔板測(cè)定示例

概述

用測(cè)試化合物制備細(xì)胞（100μL/孔用于96孔板或25μL/孔用于384孔板）

加入等體積的Caspase 3/7測(cè)定溶液

在室溫下孵育1小時(shí)

監(jiān)測(cè)Ex的熒光強(qiáng)度 / Em = 350 / 450nm

操作方法

1.準(zhǔn)備細(xì)胞：

1.1對(duì)于貼壁細(xì)胞：在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中將細(xì)胞在20,000至80,000個(gè)細(xì)胞/孔/ 90L過(guò)夜，96孔板或5,000至20,000個(gè)細(xì)胞/孔/ 20L，用于384孔板。

1.2對(duì)于非粘附細(xì)胞：從培養(yǎng)基中離心細(xì)胞，然后將細(xì)胞沉淀懸浮于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基濃度為80,000至200,000細(xì)胞/孔/ 90L，用于96孔poly-D賴氨酸平板或20,000至50,000細(xì)胞/孔/ 20L用于384孔聚-D賴氨酸板。在實(shí)驗(yàn)之前，在制動(dòng)器關(guān)閉的情況下以800rpm離心板2分鐘。

注意：應(yīng)對(duì)每個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行單獨(dú)評(píng)估，以確定誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的佳細(xì)胞密度。

2.準(zhǔn)備庫(kù)存解決方案：

2.1在使用前，在室溫下使用組分A，B，C（如果需要，組分D）。

2.2如果需要，制備1mM Caspase 3/7抑制劑Ac-DEVD-CHO儲(chǔ)備液：將100μLDMSO（未提供）直接加入到Caspase 3/7抑制劑Ac-DEVD-CHO小瓶中（組分D） ）。該抑制劑可用于確認(rèn)熒光信號(hào)強(qiáng)度與Caspase 3/7樣蛋白酶活性之間的相關(guān)性。

注意：應(yīng)將未使用的抑制劑儲(chǔ)備液等分并在-20°C下干燥儲(chǔ)存。

3.準(zhǔn)備Caspase 3/7檢測(cè)溶液：

將50μL200XCaspase 3/7底物儲(chǔ)備溶液（組分A）和100μL1MDTT溶液（組分C）加入10mL測(cè)定緩沖液（組分B）中，并充分混合。

注意：50μL的200X Caspase 3/7底物儲(chǔ)備液足以進(jìn)行100次分析，每次分析的反應(yīng)體積為100μL。未使用的200X Caspase 3/7底物儲(chǔ)備溶液應(yīng)等分并在-20°C下干燥儲(chǔ)存。遠(yuǎn)離光明。

4.運(yùn)行Caspase 3/7測(cè)定：

4.1通過(guò)在PBS或所需緩沖液中加入10μL10X測(cè)試化合物（96孔板）或5μL5X測(cè)試化合物（384-板）來(lái)處理細(xì)胞。對(duì)于空白孔（沒(méi)有細(xì)胞的培養(yǎng)基），加入相應(yīng)量的化合物緩沖液。

4.2將細(xì)胞板在37℃，5％CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)所需的一段時(shí)間（用喜shu堿處理的Jurkat細(xì)胞4-6小時(shí)）以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

4.3加入100μL/孔（96孔板）或25μL/孔（384孔板）的Caspase 3/7測(cè)定溶液（來(lái)自步驟3）。

4.4在室溫下孵育板至少1小時(shí)，避光。

注1：如果需要，在室溫下加入測(cè)定溶液10分鐘前，將1L Caspase 3/7抑制劑Ac-DEVD-CHO的1mM儲(chǔ)備液（來(lái)自步驟2.2）加入所選樣品，以確認(rèn)caspase 3 / 7個(gè)類似的活動(dòng)。

4.5在制動(dòng)器關(guān)閉的情況下，以800rpm離心細(xì)胞板（特別是對(duì)于非貼壁細(xì)胞）2分鐘。

4.6在Ex / Em = 350 / 450nm處觀察熒光增加。