樣品實(shí)驗(yàn)方案

簡要概述

將20μl反應(yīng)緩沖液（組分B）加入目標(biāo)蛋白（200μl）中
將蛋白質(zhì)溶液添加到ReadiLink Biotin SE（組分A）中
在室溫下孵育30-60分鐘
通過旋轉(zhuǎn)柱純化綴合物

工作溶液配制

蛋白質(zhì)工作溶液配制方案：
為了標(biāo)記1mg靶蛋白（假設(shè)目標(biāo)蛋白濃度為5mg / mL），將20μL（總反應(yīng)體積的10％）的反應(yīng)緩沖液（組分B）與200μL目標(biāo)蛋白溶液混合。注意：如果您的蛋白質(zhì)濃度不同，請相應(yīng)調(diào)整蛋白質(zhì)體積，使~1 mg蛋白質(zhì)可用于此標(biāo)記反應(yīng)。注意：蛋白質(zhì)溶液的pH值應(yīng)為8.5±0.5。如果蛋白質(zhì)溶液的pH低于8.0，則使用反應(yīng)緩沖液（組分B）或飽和碳s氫鈉溶液將pH調(diào)節(jié)至8.0-9.0的范圍。注意：蛋白質(zhì)應(yīng)溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中。如果蛋白質(zhì)溶解在Tris或甘an酸緩沖液中，則必須用pH7.2-7.4的1X PBS透析，以除去廣泛用于蛋白質(zhì)沉淀的游離胺或銨鹽（例如硫酸銨和乙酸銨）。注意：用牛血清白蛋白（BSA）或明膠穩(wěn)定的不純抗體或抗體可能效果不佳。疊d化鈉或硫柳汞的存在也可能干擾綴合反應(yīng)?？梢酝ㄟ^透析或旋轉(zhuǎn)柱除去疊d化鈉或硫柳汞，以獲得標(biāo)記結(jié)果。注意：如果蛋白質(zhì)濃度低于2 mg / mL，則結(jié)合效率會顯著降低。為獲得標(biāo)記效率，建議蛋白質(zhì)濃度范圍為2-10 mg / mL。

操作步驟

1.進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)

1.1將蛋白質(zhì)工作溶液加入到ReadiLink 生物sSE（組分A）的小瓶中，通過反復(fù)移液幾次將其充分混合，或者將小瓶渦旋幾秒鐘。

1.2將綴合反應(yīng)混合物在室溫下保持30-60分鐘。注意：如果需要，可以旋轉(zhuǎn)或搖動綴合反應(yīng)混合物更長的時間。

2.準(zhǔn)備旋轉(zhuǎn)柱進(jìn)行樣品純化

2.1將提供的旋轉(zhuǎn)柱（組分C）反轉(zhuǎn)幾次以重新懸浮沉降的凝膠并除去任何氣泡。

2.2將色譜柱放入洗滌管（2 mL，未提供）中。取下蓋子，讓多余的填料緩沖液通過重力排放到凝膠床的頂部。如果色譜柱沒有開始流動，請將蓋子推回色譜柱并再次將其取出以開始流動。丟棄排出的緩沖液，然后將色譜柱放回洗滌管中。但是，如果將色譜柱放入12 x 75 mm試管（未提供）中，請立即離心。

2.3在搖動式離心機(jī)中以1,000×g離心1分鐘（參見“離心注釋"部分）以除去包裝緩沖液。

2.4向柱中加入1-2 mL 1X PBS（pH 7.2-7.4）。每次施用PBS后，讓緩沖液通過重力排出，或?qū)⒅x心2分鐘以除去緩沖液。丟棄收集管中的緩沖液。重復(fù)此過程3-4次。

2.5在搖動式離心機(jī)中以1,000×g離心2分鐘（參見“離心注意事項(xiàng)"部分）以除去包裝緩沖液。

3.純化綴合物

3.1將色譜柱（從步驟準(zhǔn)備旋轉(zhuǎn)柱進(jìn)行樣品純化）放入干凈的收集管（1.5 mL，未提供）中。 小心地將樣品（100-500μL，來自步驟綴合反應(yīng)）直接加載到色譜柱中心。

3.2加載樣品后，加入300μL1XPBS（pH 7.2-7.4），使總體積為220μL至520μL。 將柱以1,000xg離心5-6分鐘，并收集含有所需生物s標(biāo)記蛋白的溶液。

4.蛋白質(zhì)綴合物的儲存

4.1抗體綴合物應(yīng)在載體蛋白（例如0.1％牛血清白蛋白）存在下以> 0.5mg / mL儲存。 當(dāng)在2mM疊d化鈉存在下儲存并且避光時，綴合物溶液可以在4℃下儲存兩個月而沒有顯著變化。 為了更長時間的儲存，可以將蛋白質(zhì)綴合物凍干或分成單次使用的等分試樣并在≤-60℃下儲存。

5.離心注意事項(xiàng)

5.1旋轉(zhuǎn)柱（組分C）可以裝入2mL微量離心管或12×75mm試管中，用于在離心過程中收集樣品。 使用2 mL微管和色譜柱進(jìn)行初始色譜柱平衡步驟。

5.2能夠產(chǎn)生1,000 x g的小力的擺動式離心機(jī)適用于Bio-Spin柱。 在特定轉(zhuǎn)速下產(chǎn)生的重力是微量離心機(jī)轉(zhuǎn)子半徑的函數(shù)。 有關(guān)從每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)（RPM）到離心力或g力的轉(zhuǎn)換信息，請參閱擺動式離心機(jī)說明手冊。 或者，使用以下等式計算達(dá)到1,000 x g重力所需的RPM速度。

5.3RCF（xg）=（1.12 x 10-5）×（RPM）×2×r（RCF是相對離心力，r是從轉(zhuǎn)子中心到Bio-Spin柱中間測量的以厘米為單位的半徑 ，RPM是轉(zhuǎn)子的速度）。