操作步驟

1.準備HHBS緩沖液，10％Pluronic®F-127溶液和25 mM Probenecid溶液。

2.在高質(zhì)量無水DMSO中制備2 mM至5 mM Calcein Red AM原液。
2.1使用Calcein Red AM的量：1毫克
2.2所需濃度：2 mM
2.3在合適的容器中，將1mg Calcein Red TM AM與492.23μL無水DMSO混合。

3.使用10μMCalceinRed AM 4在HHBS中制備2X工作溶液，0.08％Pluronic®F-127和2 mM丙H舒。
3.1終孔內(nèi)濃度的Calcein Red AM：5μM
3.2Pluronic®F-127的終井內(nèi)濃度：0.04％
3.3終孔內(nèi)濃度的丙H舒：1mM
3.4在合適的容器中，混合16μL的Calcein Red AM，25.6μL的10％Pluronic F-127和256μL的25mM丙H舒。然后，添加HHBS或您選擇的緩沖液，直到體積為3.2 mL。
注意：對于大多數(shù)細胞系，我們建議Calcein Red AM的終濃度為4至5μM。
注意：推薦的Pluronic F-127孔濃度終為0.02％至0.04％。
注意：推薦的終濃度為1至2.5 mM的Probenecid。

4.將100μL染料工作溶液加入已經(jīng)含有100μL培養(yǎng)基的所需孔中。
4.1該步驟將染料工作溶液從2X稀釋至1X，并將每種組分的終濃度調(diào)節(jié)至以下：5μM的Calcein Red AM，0.04％Pluronic F-127,1mM丙H舒。

5.孵育染料
5.1將染料加載板在細胞培養(yǎng)箱中孵育20-60分鐘。
5.2將染料加載板在室溫下孵育30分鐘。

6.用1.0 mM Probenecid準備HHBS緩沖液（或您選擇的緩沖液）。
6.1在合適的容器中加入160μL的25mM丙H舒。然后，添加HHBS或您選擇的緩沖液，直到體積為4 mL。

7.用HHBS緩沖液或您選擇的緩沖液替換染料工作溶液，使用1.0 mM Probenecid。
7.1首先，從所需孔中除去200μL染料工作溶液和培養(yǎng)基。
7.2在相同的孔中加入200μL含有1.0mM丙H舒的HHBS（或您選擇的緩沖液）。

8.運行實驗
8.1為您的樣品添加所需的處理。
8.2以Ex / Em = 560/574 nm運行實驗。