鈣離子熒光探針Fluo-3FF, AM是美國(guó)AAT生產(chǎn)的用于鈣通量測(cè)定的試劑，鈣通量測(cè)定是用于篩選G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）的藥物發(fā)現(xiàn)中的優(yōu)選方法。 我們的Quest Fluo-8 和Rhod-4 系列鈣檢測(cè)試劑是亮的綠色和紅色鈣指示劑。 我們的其他鈣指標(biāo)如Fluo-3，F(xiàn)ura-2，Indo-1，Rhod-5N和Rhod-2 AM也具有與市場(chǎng)上相比高的質(zhì)量。百螢生物是AAT Bioquest 的中國(guó)代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的鈣離子熒光探針Fluo-3FF, AM。

實(shí)驗(yàn)方案

儲(chǔ)備溶液配制

在高質(zhì)量無(wú)水DMSO制備2至5 mM 的Fluo-3 AM中儲(chǔ)備溶液。

工作溶液配制

Fluo-3 AM工作溶液
1.在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將Fluo-3AM溶解在DMSO中，或?qū)⒅甘緞﹥?chǔ)備溶液的等分試樣解凍至室溫。

2.在含有0.04%Pluronic®F-127的緩沖液（例如Hanks和Hepes緩沖液）中制備2至20µM Fluo-3 AM工作溶液。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞系，建議使用最終濃度為4-5μM的Fluo-3 AM。細(xì)胞負(fù)載所需指示劑的確切濃度請(qǐng)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。

注：非離子洗滌劑Pluronic F-127用于提高Fluo-3 AM的水溶性。可從百螢購(gòu)買各種Pluronic F-127溶液。
注：如果你的細(xì)胞含有有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可以將丙H舒（1-2mM）添加到染料工作溶液中（最終井內(nèi)濃度為0.5-1mM），以減少酯化指示劑的泄漏。多種形式的丙H舒產(chǎn)品，包括水溶性、鈉鹽和穩(wěn)定溶液，可從百螢購(gòu)買。

操作步驟

以下是我們推薦的將AM酯加載到活細(xì)胞中的方案。本方案僅提供指南，實(shí)際應(yīng)根據(jù)您的具體需求進(jìn)行修改。

1.在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞過(guò)夜。
2.第二天，將1X Fluo-3 AM工作溶液添加到孔板中。
注意：如果你的化合物干擾血清，在染色前用新鮮的HHBS緩沖液代替生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
3.將加入染料的孔板在37°C的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30至60分鐘。
注：將染料培養(yǎng)2小時(shí)以上可以提高某些細(xì)胞系的信號(hào)強(qiáng)度。
4.用HHBS或您選擇的緩沖液（含有陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑，如1mM丙H舒）代替染料工作溶液，以去除任何多余的探針。
5.根據(jù)需要添加刺激物，并同時(shí)使用配備有FITC濾波片組的熒光顯微鏡或包含可編程液體處理系統(tǒng)（如FDSS、FLIPR或FlexStation）的熒光酶標(biāo)儀在490/525nm，Cutoff=515nm處檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

圖示

將U2OS細(xì)胞以40,000個(gè)細(xì)胞/100μL/孔接種過(guò)夜，置于96孔黑色壁/透明底板中。 除去生長(zhǎng)培養(yǎng)基，將細(xì)胞分別與100μLFluo-3 AM，F(xiàn)luo-4 AM和Fluo-8 AM在HHBS中以4μM濃度在37℃，5％CO 2中溫育。 孵化器1小時(shí)。 用200μLHHBS洗滌細(xì)胞兩次，然后使用FITC通道用熒光顯微鏡（Olympus IX71）成像。