使用Cal-520 AM，Cal-570 AM或Cal-630 AM酯類

1.使用Cal-520 ，Cal-590 或Cal-630 AM酯：

       AM酯是非極性酯，其易于穿過活細胞膜，并且通過活細胞內(nèi)的細胞酯酶快速水解。AM酯廣泛用于非侵入性地將各種極性熒光探針裝載到活細胞中。但是，使用AM酯時必須小心，因為它們易于水解，特別是在溶液中。它們應(yīng)在使用前重新配制成高質(zhì)量的無水二甲基亞砜（DMSO）。DMSO儲備溶液可以在-20℃下干燥儲存并避光。在這些條件下，AM酯應(yīng)穩(wěn)定數(shù)月。以下是我們推薦的將Cal-520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM酯加入活細胞的方案。該方案僅提供指南，實際應(yīng)根據(jù)您的具體需求進行修改。

a）在高質(zhì)量無水DMSO中制備2至5 mM Cal-520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM酯的儲備溶液。

b）在實驗當(dāng)天，將Cal-520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM溶解在DMSO中或?qū)⒌确莸闹甘緞﹥淙芤航鈨鲋潦覝?。在Hanks和Hepes緩沖液（HHBS）或您選擇的緩沖液（0.04％Pluronic®F-127）中制備10至20μM的染料工作溶液。細胞加載所需指示劑的確切濃度必須憑經(jīng)驗確定。

注意：非離子型洗滌劑Pluronic®F-127有時用于增加Cal-520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM酯的水溶性。

c）如果您的細胞（如CHO細胞）含有有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白，可將丙*舒（1-2 mM）加入染料工作溶液中（終濃度為0.5-1 mM）以減少滲漏去酯化指標(biāo)。

d）將等體積的染料工作溶液（來自步驟b或c）加入細胞板中。

e）將染料加載板在細胞培養(yǎng)箱中孵育60至90分鐘，然后在室溫下將板孵育另外30分鐘。

注意：孵育染料超過2小時可以為某些細胞系提供更好的信號強度。

f）用HHBS或您選擇的緩沖液（含有陰離子轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑，如1mM丙*舒，如果適用）替換染料工作溶液，以去除多余的探針。

g）在Ex / Em = 490 / 525nm（對于Cal-520 AM），540 / 5000nm（對于Cal-590 AM）或600 / 640nm（對于Cal-630 AM）進行實驗。

2.測量細胞內(nèi)鈣響應(yīng)：

為了確定溶液的游離鈣濃度或單波長鈣指示劑的Kd，使用以下等式：

[Ca]free = Kd[F ─ Fmin]/Fmax ─ F]

其中F是實驗鈣水平下指示劑的熒光，F(xiàn)min是不存在鈣時的熒光，F(xiàn)max是鈣飽和探針的熒光。

       解離常數(shù)（Kd）是探針對鈣的親和力的量度。 與校準(zhǔn)溶液相比，熒光指示劑的Ca結(jié)合和光譜性質(zhì)在細胞環(huán)境中變化非常顯著。 細胞內(nèi)指標(biāo)的原位反應(yīng)校準(zhǔn)通常產(chǎn)生顯著高于體外測定的Kd值。 通過在離子載體如A-23187,4-溴A-23187和離子霉素存在下將加載的細胞暴露于受控的Ca2+緩沖液來進行原位校準(zhǔn)。 或者，細胞透化劑如洋地黃皂苷或X-100可用于將指示劑暴露于細胞外培養(yǎng)基的受控Ca2+水平。