樣品實(shí)驗(yàn)方案

簡要概述

1. 準(zhǔn)備細(xì)胞

2. 除去生長培養(yǎng)基

3. 加入I-Loading Buffer，用篩選化合物處理細(xì)胞

4. 用DPBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次

5. 用1X裂解液裂解細(xì)胞

6. 添加等體積的I-sensor（50或25 µL）

7. 將0.1X加到I- Sensor Enhancer（50或25 µL）

8. 在室溫下孵育10秒至10分鐘

9. 檢測380 nm，405 nm或630 nm處的吸光度

溶液配制

儲(chǔ)備溶液配制

細(xì)胞裂解緩沖液（1X）：將整個(gè)小瓶的10X細(xì)胞裂解緩沖液（組分D）添加到45 mL無菌H2O中，并充分混合。 注意：5 mL 1X細(xì)胞裂解緩沖液足以裝滿一塊板。 將未使用的1X細(xì)胞裂解緩沖液儲(chǔ)存在4℃。

工作溶液配制

I- Sensor Enhancer工作溶液（1X）：將50 µL 100X碘化物增強(qiáng)指示劑（組分B）加入5 mL無菌H2O中并充分混合。 注意：1X I- Sensor Enhancer工作溶液不穩(wěn)定，請(qǐng)稀釋后2小時(shí)內(nèi)使用。 注意：應(yīng)單獨(dú)評(píng)估每個(gè)細(xì)胞系，以確定I-Sensor Enhancer溶液的稀釋度。 我們觀察到0.1X I-Sensor Enhancer工作溶液在某些細(xì)胞系中效果更好。

實(shí)驗(yàn)步驟

1.碘化物流出測定

1.1從細(xì)胞板上吸出生長培養(yǎng)基。

1.2加入100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的預(yù)熱I-上樣緩沖液（組分C）并孵育2-4小時(shí)。

1.3全部吸出碘化物上樣緩沖液。 用DPBS或HBSS清洗細(xì)胞至少3次。

1.4在HBSS緩沖液中用激動(dòng)劑處理細(xì)胞5分鐘。 注意：為篩選拮抗劑，將化合物與I上樣緩沖液孵育至少30分鐘，然后再用DPBS或HBSS緩沖液洗滌細(xì)胞。

1.5吸出上清液。

1.6通過添加50 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的1X細(xì)胞裂解緩沖液來裂解細(xì)胞。

1.7進(jìn)行碘化物測定。

2.用于碘化物流入分析

2.1從細(xì)胞板上吸出生長培養(yǎng)基。

2.2加入預(yù)熱的I-上樣緩沖液（組分C）和測試化合物100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）并孵育5分鐘。

2.3全部吸出碘化物上樣緩沖液。 用HBSS洗滌細(xì)胞3次。

2.4通過添加50 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的1X細(xì)胞裂解緩沖液來裂解細(xì)胞。

2.5進(jìn)行碘化物測定。

3.運(yùn)行碘化物測定

3.1從碘化物流入/流出測定選擇的孔中添加50 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的Iodide Blue 指示劑（組分A）。

3.2向混合物中加入50 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的1X碘化物指示劑增強(qiáng)劑溶液。 注意：對(duì)于某些細(xì)胞系，您可能需要將增強(qiáng)劑溶液稀釋至0.1X。

3.3在室溫下孵育10秒-10分鐘。 注意：應(yīng)單獨(dú)評(píng)估每個(gè)細(xì)胞系，以確定孵育時(shí)間。 注意：由于存在高濃度的碘化物，藍(lán)色可能在數(shù)秒至數(shù)分鐘內(nèi)變?yōu)辄S色。

3.4檢測630、380或405 nm處的吸光度。