樣品實(shí)驗(yàn)方案

1.準(zhǔn)備線粒體染色溶液：

1.1將MitoLite 染料加熱至室溫。

1.2通過(guò)將20 µL的500 X Mitolite 染料稀釋到10 mL的Hanks和20 mm Hepes緩沖液或您選擇的緩沖液（HBSS）中來(lái)制備染料工作液。

注1：20 µL Mitolite 染料足以用于一塊96孔板。 分裝并在<-15℃下存儲(chǔ)未使用的MitoLite 染料原液。 避免光照，并避免重復(fù)的凍融循環(huán)。

注2：熒光線粒體指示劑的濃度因具體應(yīng)用而異。 可以根據(jù)特定的細(xì)胞類型和細(xì)胞或組織對(duì)探針的滲透性來(lái)改變?nèi)旧珬l件。

2.準(zhǔn)備和染色細(xì)胞：

2.1對(duì)于貼壁細(xì)胞：a）在96孔黑色壁/透明底板（100 µL /孔/ 96孔板）中或在裝有適當(dāng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)的蓋玻片上生長(zhǎng)細(xì)胞。 當(dāng)細(xì)胞達(dá)到所需的匯合度時(shí)，添加等體積的染料工作溶液（來(lái)自步驟1.2）。 b）將細(xì)胞在37°C，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育30分鐘至2小時(shí)。 C）更換染料加載溶液，或用預(yù)熱的（37°C）漢克斯和20 mM Hepes緩沖液（HBSS）或您選擇的緩沖液（例如，含有1：1濃度的生長(zhǎng)培養(yǎng)基的緩沖液）洗滌細(xì)胞（尤其對(duì)于cat＃22679） ）。用HBSS或生長(zhǎng)培養(yǎng)基填充細(xì)胞孔。 d）。使用裝有所需濾光片組的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。

注意：建議增加標(biāo)記濃度或孵育時(shí)間，以使染料在細(xì)胞未充分染色的情況下積累。

2.2對(duì)于懸浮細(xì)胞：以1000 rpm離心細(xì)胞5分鐘，以獲得細(xì)胞沉淀并吸出上清液。在預(yù)熱的（37°C）生長(zhǎng)培養(yǎng)基中輕輕重懸細(xì)胞沉淀，并加入等體積的染料工作溶液（來(lái)自步驟1.2）。將細(xì)胞在37°C，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育30分鐘至2小時(shí)。更換染料加載溶液或用Hanks和20 mM Hepes緩沖液（HH緩沖液）或您選擇的緩沖液（例如具有1：1濃度的生長(zhǎng)培養(yǎng)基的緩沖液）洗滌細(xì)胞（特別是對(duì)于cat＃22679）。用HBSS或生長(zhǎng)培養(yǎng)基填充細(xì)胞孔。使用裝有所需濾光片組的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。

注1：建議增加標(biāo)記濃度或孵育時(shí)間，以使染料在細(xì)胞似乎未充分染色的情況下積累。

注2：懸浮細(xì)胞可以附著在已經(jīng)用BDCell-Tak®（BD Biosciences）處理過(guò)并被染色為貼壁細(xì)胞的蓋玻片上（參見(jiàn)步驟2.1）。