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熒光革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌染色試劑盒是美國(guó)AAT Bioquest生產(chǎn)的染色細(xì)菌的試劑盒，AAT Bioquest的染色試劑盒提供了一種新穎的一步熒光測(cè)定法，用于確定活菌中的革蘭氏菌。革蘭氏染色是在臨床和研究環(huán)境中對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類的重要且廣泛使用的方法。原始方法涉及很多步驟，例如熱固定，兩步染色方案，酒精提取和復(fù)染。這些步驟可能會(huì)導(dǎo)致不一致的染色。 AAT Bioquest的一站式工具包消除了更多步驟，從而克服了出現(xiàn)的問(wèn)題。該試劑盒使用了熒光標(biāo)記的伴刀豆球蛋白A（ConA），這是一種凝集素，可選擇性地與暴露于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌表面的N-乙酰氨基葡糖結(jié)合。當(dāng)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌用熒光標(biāo)記的ConA共軛物染色時(shí)，只有革蘭氏陽(yáng)性菌發(fā)出紅色熒光。染色的細(xì)菌可以通過(guò)熒光監(jiān)測(cè)。因?yàn)榕c其他現(xiàn)有染料相比，我們?cè)噭┖兄惺褂玫臒晒鈽?biāo)記ConA共軛物顯示出更高的亮度和光穩(wěn)定性。百螢生物是AAT Bioquest的中國(guó)代理商，為您提供的熒光革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌染色試劑盒。

適用儀器

熒光顯微鏡
Ex:	650 nm
Em：	669 nm
推薦孔板:	黑色透明底板
濾波片組:	Cy5 濾波片組

實(shí)驗(yàn)方案

樣品實(shí)驗(yàn)方案

簡(jiǎn)要概述

1.準(zhǔn)備細(xì)菌樣本
2.準(zhǔn)備并添加IF647-ConA
3.在黑暗中于室溫下將細(xì)菌樣品與IF647-ConA孵育5-15分鐘
4.去除IF647-ConA染色溶液并重懸于測(cè)定緩沖液中
5.使用Cy5濾光片組通過(guò)熒光顯微鏡分析樣品

溶液制備

1.儲(chǔ)備溶液配制

所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。
1.1IF647-ConA儲(chǔ)備溶液（100X）：
向IF647-ConA小瓶（組分A）中加入100 µL測(cè)定緩沖液（組分B），并充分混合。注意：將儲(chǔ)備溶液儲(chǔ)存在-20oC，避免光照，并以較小的等分試樣儲(chǔ)存，以避免重復(fù)的凍融循環(huán)。

樣品示例及操作

1.細(xì)菌樣品的制備

1.1在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中使細(xì)菌生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)后期。準(zhǔn)備細(xì)菌樣品，濃度范圍為106到108個(gè)細(xì)胞/ mL。注意：在波長(zhǎng)= 600 nm（OD600）處測(cè)量細(xì)菌培養(yǎng)物的光密度，以確定細(xì)胞數(shù)。對(duì)于大腸桿菌培養(yǎng)，OD600 = 1.0等于8 x 108細(xì)胞/ mL。

1.2通過(guò)以10,000 x g離心5分鐘除去培養(yǎng)基，然后將沉淀重新懸浮在測(cè)定緩沖液（組分B）中。

2.染色方案

2.1向100 µL細(xì)菌樣品中加入1 µL IF647-ConA儲(chǔ)備溶液（100X）。

2.2充分混合，然后在室溫下于黑暗中孵育5-15分鐘。

2.3以10,000 x g離心5分鐘，然后除去IF647-ConA染色溶液。

2.4重懸于100 µL分析緩沖液（組分B）中。

2.5使用熒光顯微鏡通過(guò)Cy5（Ex / Em = 650/669 nm）通道監(jiān)控細(xì)菌的熒光。注意：該協(xié)議僅提供指導(dǎo)，應(yīng)根據(jù)不同的細(xì)菌菌株或其他特定需求進(jìn)行優(yōu)化。如果觀察到更高的背景，則可以在成像之前添加一個(gè)可選的檢測(cè)緩沖液（組分B）洗滌步驟。