操作步驟

用Tide Quencher 染料標記氨基修飾的寡核苷酸

以下方案已經(jīng)過優(yōu)化，可用于標記200μg（~6 A260 nm單位）的專有寡核苷酸。您需要修改協(xié)議，以通過多次實驗為您的特定應(yīng)用程序獲得佳結(jié)果。您的氨基改性O(shè)LIGO必須進行處理以去除快速反應(yīng)并消耗染料SUCCINIMIDYL酯的氨。

1.制備Oligo溶液（溶液A）將氨基修飾的oligo（~200μg）溶解在四硼酸鹽緩沖液（100μL，pH 8.5±0.5）中。

注1：寡核苷酸必須在5'末端用胺基合成。參見Appenxidx 1純化氨基修飾的寡核苷酸。

注2：避免使用含有伯胺的緩沖液，如Tris，因為它們與胺反應(yīng)性化合物競爭結(jié)合。

2.準備染料溶液（溶液B）

2.1通過上下吸移將1mg染料SE溶解在100μLDMSO中（如果可能，> 10mg / mL）。將小瓶側(cè)面的溶液原液離心至小瓶底部。

注意：在開始綴合之前準備DMSO染料溶液。染料溶液的長期儲存可降低染料活性。任何含有染料的溶液都應(yīng)避光。我們不建議您存儲DMSO染料溶液以備將來使用。

3.運行共軛反應(yīng)

3.1在攪拌或搖動（保持反應(yīng)混合物避光）的同時向染料溶液（B，20-50μL）中加入寡聚物溶液（A，100μL）。

3.2在室溫下在旋轉(zhuǎn)器或振蕩器上旋轉(zhuǎn)或搖動反應(yīng)混合物4-6小時。

注意：在第一個小時內(nèi)每10分鐘輕輕渦旋一下小瓶，以確保反應(yīng)溶液保持充分混合。不要劇烈混合，因為材料可能留在小瓶的兩側(cè)。六小時后，應(yīng)標記50-90％的胺修飾的寡核苷酸分子。如果更方便的話，反應(yīng)可以孵育過夜。然而，在大多數(shù)情況下，過夜孵育不會導(dǎo)致更高的標記效率。

4.純化染料 - 寡糖結(jié)合物

4.1通過乙醇沉淀標記的寡核苷酸進行初步純化

a.將20μL（一般十分之一反應(yīng)溶液體積）的3M NaCl和300μL冷無水乙醇（通常為兩個半反應(yīng)溶液體積）加入反應(yīng)小瓶中。

b.充分混合溶液并將其置于-20℃下30分鐘。

c.將該溶液在微量離心機中以10,000至15,000×g離心30分鐘。

d.注意：如果離心時間不夠長，可能會導(dǎo)致樣品丟失。

f.小心取出上清液，用冷的70％乙醇沖洗沉淀1-3次并短暫干燥。

g.注意：一些未反應(yīng)的標記試劑可能在反應(yīng)過程中沉淀或可能粘在反應(yīng)瓶的壁上。在離心之前，通過大量渦旋混合將該材料全部再溶解。重新溶解標記試劑可確保沉淀的寡核苷酸少被未反應(yīng)的標記物污染。

4.2通過HPLC或凝膠電泳進行終純化

使用Tide Quencher 染料標記肽

以下方案已經(jīng)過優(yōu)化，用于標記10 mg僅含有一個游離氨基的肽（MW~2000）。您需要修改方案，以便通過多個實驗為您的特定應(yīng)用程序提供佳結(jié)果。

1.制備肽溶液（溶液A）

1.1將肽（~10 mg）溶解在DMF（~1 ml）中。

注1：肽必須用堿如三乙胺或碳酸鉀中和。

注2：避免使用含有伯胺的緩沖液，如Tris，因為它們與胺反應(yīng)性化合物競爭結(jié)合。

2.準備染料溶液（溶液B）

2.1通過上下吸移將5mg染料SE溶解在500μLDMF中（如果可能，> 10mg / mL）。

2.2注意：在開始綴合之前準備DMF染料溶液。染料溶液的長期儲存可降低染料活性。任何含有染料的溶液都應(yīng)避光。我們不建議您存儲DMF染料溶液以備將來使用。

3.運行共軛反應(yīng)

3.1向染料溶液（B，500μL）中加入肽溶液（A，1mL），攪拌或搖動（保持反應(yīng)混合物不發(fā)光）。

3.2在室溫下攪拌反應(yīng)混合物4-6小時。

4.純化染料 - 肽綴合物

4.1濃縮反應(yīng)溶液并在C18柱上純化，得到所需的綴合物。通過HPLC分析級分，合并> 97％純度的級分并凍干。

4.2注1：HPLC純化條件：TEAB緩沖液（三乙基碳酸氫銨，0.25mmol，pH = 7.0-8.0）用作緩沖液A，乙腈用作緩沖液B. HPLC在60分鐘內(nèi)從0％B至30％B進行（流速：100毫升/分鐘）。

4.3注2：操作過程中避免強光。