溶液配制方案

除非另有說(shuō)明，所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分成一次性等份，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C。避免反復(fù)凍融循環(huán)。

1.ATTO 647N 馬來(lái)酰亞胺儲(chǔ)備溶液（溶液 B） ：

將無(wú)水 DMSO 添加到 ATTO 647N 馬來(lái)酰亞胺小瓶中，制成 10 mM 儲(chǔ)備溶液。通過(guò)移液或渦旋充分混合。

注意     開(kāi)始綴合前準(zhǔn)備染料儲(chǔ)備溶液（溶液 B）。及時(shí)使用。延長(zhǎng)儲(chǔ)存染料原液可能會(huì)降低染料活性。避光防潮時(shí)，溶液 B 可在冰箱中保存長(zhǎng)達(dá) 4 周。避免凍融循環(huán)。

2. 蛋白原液（A液）

將 100 μL 反應(yīng)緩沖液（例如，pH ~6.0 的 100 mM MES 緩沖液）與 900 μL 目標(biāo)蛋白溶液（例如抗體，蛋白濃度 > 2 mg/mL 如果可能）混合，得到 1 mL 蛋白標(biāo)記庫(kù)存溶液。

注1：蛋白質(zhì)溶液（溶液 A）的 pH 應(yīng)為 6.5 ± 0.5。

注2：不純的抗體、穩(wěn)定的牛血清蛋白（BSA）抗體或明膠不會(huì)被很好的標(biāo)記。疊D化鈉或硫柳汞的存在也可能干擾綴合反應(yīng)?？梢酝ㄟ^(guò)透析或旋轉(zhuǎn)柱除去疊D化鈉或硫柳汞，以獲得標(biāo)記結(jié)果。

注3：如果蛋白質(zhì)濃度低于 2 mg/mL，結(jié)合效率會(huì)顯著降低。為了獲得z佳標(biāo)記效率，建議蛋白質(zhì)濃度范圍為 2-10 mg/mL。

可選：如果您的蛋白質(zhì)不含游離半胱an酸，則必須用 DTT 或 TCEP 處理蛋白質(zhì)以生成硫醇基團(tuán)。 DTT 或 TCEP 用于將二硫鍵轉(zhuǎn)化為兩個(gè)游離硫醇基團(tuán)。如果使用 DTT，則必須在將馬來(lái)酰亞胺染料與蛋白質(zhì)結(jié)合之前通過(guò)透析或凝膠過(guò)濾除去游離 DTT。以下是生成游離硫醇基團(tuán)的示例方案：

1.在蒸餾水中制備 1 M DTT (15.4 mg/100 µL) 的新鮮溶液。

2.在 20 mM DTT 中制備 IgG 溶液：混合時(shí)每 ml IgG 溶液添加 20 µL DTT 庫(kù)存。在室溫下靜置 30 分鐘，無(wú)需額外混合（以盡量減少半胱an酸再氧化為胱an酸）。

3.將還原的 IgG 通過(guò)用“交換緩沖液"預(yù)平衡的過(guò)濾柱。從柱中收集 0.25 mL 餾分。

4.確定蛋白質(zhì)濃度并將大部分 IgG 的級(jí)分合并。這可以通過(guò)分光光度法或比色法來(lái)完成。

5.此步驟后盡快進(jìn)行綴合。

注意：為了獲得z佳結(jié)果，IgG 溶液應(yīng) >4 mg/mL。如果抗體低于 2 mg/mL，則應(yīng)濃縮。額外包括 10% 的緩沖液交換柱損失。

注意：幾乎可以在 pH 7-7.5 的任何緩沖液中進(jìn)行還原，例如 MES、磷酸鹽或 TRIS 緩沖液。

注意：步驟 3 和 4 可以用透析代替。