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免疫組化（IHC）基本原理及操作流程
點擊次數(shù)：5037 發(fā)布時間：2012-10-22
【基本原理】
免疫組化是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理——抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標記抗體的顯色劑 （熒光素、酶、金屬離子、同位素） 顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)（immunohistochemistry）或免疫細胞化學(xué)技術(shù)（immunocytochemistry）。
*，抗體與抗原之間的結(jié)合具有高度的特異性。免疫組化正是利用這一特性，即先將組織或細胞中的某些化學(xué)物質(zhì)提取出來，以其作為抗原或半抗原去免疫小鼠等實驗動物，制備特異性抗體，再用這種抗體（*抗體）作為抗原去免疫動物制備第二抗體，并用某種酶（常用辣根過氧化物酶）或*等處理后再與前述抗原成分結(jié)合，將抗原放大，由于抗體與抗原結(jié)合后形成的免疫復(fù)合物是無色的，因此，還必須借助于組織化學(xué)方法將抗原抗體反應(yīng)部位顯示出來（常用顯色劑DAB顯示為棕黃色顆粒）。通過抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng)，顯示細胞或組織中的化學(xué)成分，在顯微鏡下可清晰看見細胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)物，從而能夠在細胞或組織原位確定某些化學(xué)成分的分布、含量。組織或細胞中凡是能作抗原或半抗原的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應(yīng)的特異性抗體進行檢測。
免疫組織化學(xué)技術(shù)按照標記物的種類可分為免疫熒光法、免疫酶法、免疫鐵蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。
用于病理診斷的主要有免疫熒光法和免疫酶法。免疫熒光法是現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中廣泛應(yīng)用的方法之一，包括熒光抗體和熒光抗原技術(shù)，具有抗原抗體反應(yīng)的特異性，染色技術(shù)的快速性，在細胞或組織上定位的準確性，以及熒光效應(yīng)的靈敏性等優(yōu)勢。但是，由于免疫熒光法必須具有熒光顯微鏡，熒光強度隨時間的延長而逐漸消退，結(jié)果不易長期保存等缺點，在普及應(yīng)用上受到一定限制，而逐漸被免疫酶法所取代。
【操作規(guī)程】
（一）、儀器設(shè)備
1）18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或醫(yī)用微波爐； 2）水浴鍋
（二）、試劑
1）PBS緩沖液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。
2）0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液（CB，pH6.0，1000ml）：檸檬酸三鈉 3g，檸檬酸 0.4g。
3）0.5mol/L EDTA緩沖液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH調(diào)至pH8.0,加水至1000ml。
4）1mol/L的TBS緩沖液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris堿，用1N的HCl調(diào)至pH8.0,加水至1000ml。
5）酶消化液： a、0.1%*液：用0.1%CaCl2（pH7.8） 配制。 b、0.4%*液：用0.1N的HCl配制。
6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
7）封裱劑：
a、甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.0～9.5）等量混合；
b、油和TBS（或PBS）配制。
8）TBS/PBS pH9.0～9.5，適用于熒光顯微鏡標本；pH7.0～7.4適合于光學(xué)顯微鏡標本。
（三）、操作流程
1、脫蠟和水化
脫蠟前，應(yīng)將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘。
1）組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后再浸泡10分鐘；
2）無水乙醇中浸泡5分鐘；
3）95%乙醇中浸泡5分鐘；
4）70%乙醇中浸泡5分鐘；
2、抗原修復(fù)
用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片。
1）抗原熱修復(fù)
（1）高壓熱修復(fù) 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M*緩沖溶液（pH6.0）。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子，但不進行鎖定。將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。10分鐘后，去除熱源，置入涼水中，當(dāng)小閥門沉下去后打開蓋子。本方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復(fù)。
（2）煮沸熱修復(fù) 電爐或者水浴鍋加熱0.01M*緩沖溶液（pH6.0）至95℃左右，放入組織芯片加熱10~15分鐘。
（3）微波熱修復(fù) 在微波爐里加熱0.01M*緩沖溶液（pH6.0）至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔5~10分鐘，反復(fù)1-2次。適用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。
2）酶消化方法
常用0.1%*和0.4%*液。*使用前預(yù)熱至37℃，切片也預(yù)熱至37℃，消化時間約為5~30分鐘；*消化37℃時間為30分鐘。適用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。
3、免疫組織化學(xué)染色
SP法
1）脫蠟、水化；
2）PBS洗2～3次各5分鐘；
3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘；
4）PBS洗2～3次各5分鐘；
5）抗原修復(fù)；
6）PBS洗2～3次各5分鐘；
7）滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體。
8）滴加Ⅰ抗50μl，室溫靜置1小時或者4℃過夜或者37℃1小時。
9）4℃過夜后需在37℃復(fù)溫45分鐘。
10）PBS洗3次各5分鐘；
11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室溫靜置，或37℃1小時；
12）II抗中可加入0.05%的tween-20。
13）PBS洗3次各5分鐘；
14）DAB顯色5～10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度；
15）PBS或自來水沖洗10分鐘；
16）蘇木精復(fù)染2分鐘，鹽酸酒精分化；
17）自來水沖洗10～15分鐘；
18）脫水、透明、封片、鏡檢。
SABC法
1）脫蠟、水化。
2）PBS洗兩次各5分鐘。
3）用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉5～10分鐘，蒸餾水洗3次。
4）抗原修復(fù)。
5）PBS洗5分鐘。
6）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體。
7）滴加Ⅰ抗,室溫1小時或者4℃過夜或者37℃1小時（4℃過夜后在37℃復(fù)溫45分鐘）。
8）PBS洗三次每次2分鐘。
9）滴加*化二抗,20℃～37℃20分鐘。
10）PBC洗3次每次2分鐘。
11）滴加試劑SABC，20℃～37℃20分鐘。
12）PBS洗4次每次5分鐘。
13）DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）。
14）蒸餾水洗。蘇木素復(fù)染2分鐘、鹽酸酒精分化。
15）脫水、透明、封片、鏡檢。