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YIJI 細(xì)胞NADPH*還原酶（NADPH Cytochrome C Reductase）活性 比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）
點(diǎn)擊次數(shù)：686 發(fā)布時(shí)間：2013-12-25
YIJI 細(xì)胞NADPH細(xì)胞色素C還原酶（NADPH Cytochrome C Reductase）活性
比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）
主要用途
YIJI細(xì)胞NADPH細(xì)胞色素C還原酶（NADPH Cytochrome C Reductase）活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過NADPH細(xì)胞色素C還原酶反應(yīng)系統(tǒng)中，細(xì)胞色素C還原后峰值的增高，即采用比色法來測(cè)定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體）或純化微粒體樣品NADPH細(xì)胞色素C還原酶的活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。
技術(shù)背景
NADPH細(xì)胞色素C還原酶（NADPH Cytochrome C Reductase；EC1.6.2.4），又稱為NADPH細(xì)胞色素C還原酶（NADPH-cytochrome P450 reductase；CPR），是一種微粒體（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）內(nèi)電子傳導(dǎo)鏈的黃素蛋白酶，參與藥物、脂肪酸、固醇類、外源性化學(xué)分子等羥基化代謝作用，啟動(dòng)脂質(zhì)過氧化作用。通過傳遞來自NADPH的電子到細(xì)胞色素b5或細(xì)胞色素P450家系的酶，包括血紅素氧合酶等，然后鏈接到脂肪酸去飽和酶（desaturase）和延伸酶（elongase）通路上。NADPH細(xì)胞色素C還原酶存在于所有組織細(xì)胞，肝組織高度表達(dá)，受到垂體-甲狀腺軸調(diào)控。NADPH細(xì)胞色素C還原酶是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的標(biāo)記蛋白，飲食類脂質(zhì)和生態(tài)污染的生物學(xué)標(biāo)記。基于底物氧化型細(xì)胞色素C，在輔酶NADPH的存在下，由NADPH細(xì)胞色素C還原酶催化作用，產(chǎn)生還原型細(xì)胞色素C，由此出現(xiàn)吸光峰值的變化（550nm波長(zhǎng)），來定量測(cè)定NADPH細(xì)胞色素C還原酶的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：
產(chǎn)品內(nèi)容
YIJI清理液（Reagent A） 毫升
YIJI裂解液（Reagent B） 毫升
YIJI緩沖液（Reagent C） 毫升
YIJI反應(yīng)液（Reagent D） 毫升
YIJI底物液（Reagent E） 毫升
YIJI陰性液（Reagent F） 毫升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存YIJI反應(yīng)液（Reagent D）和YIJI底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；YIJI底物液（Reagent E）避免光照；有效保證6月
用戶自備
15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器
細(xì)胞刮脫棒：用于脫離貼壁細(xì)胞
DOUNCE勻漿器：用于裂解細(xì)胞
微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作
超速離心機(jī)：用于樣品操作
比色皿：用于反應(yīng)和比色的容器
分光光度儀：用于比色分析
實(shí)驗(yàn)步驟
一、 樣品準(zhǔn)備
1． 準(zhǔn)備好75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 107細(xì)胞）
2． 小心加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面
3． 小心抽去清理液
4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用*消化）
5． 加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）
7． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
8． 小心抽去上清液
9． 加入xx微升YIJI裂解液（Reagent B）
10． 渦旋震蕩5秒，充分混勻
11． 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
12． 在冰槽里用勻漿棒勻化細(xì)胞（約40下）
13． 將所有細(xì)胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
14． 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心30分鐘，速度為9000g
15． 移取上清液到2個(gè)新的1.5毫升離心管
16． 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心60分鐘，速度為100000g
17． 小心抽去上清液
18． 分別加入xx微升YIJI裂解液（Reagent B）
19． 合并到1個(gè)1.5毫升離心管
20． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用GENMED BCA蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30031.1）
21． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
二、 測(cè)定準(zhǔn)備
1． 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)胞裂解萃取液或微粒體樣品等），置于冰槽里
2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長(zhǎng)為550nm，間隔60秒，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零
3． YIJI緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
三、 背景對(duì)照測(cè)定
1． 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent D）
3． 加入xx微升YIJI底物液（Reagent E）
4． 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
5． 加入xx微升YIJI陰性液（Reagent F）
6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
7． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照：550波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘－550波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘
四、 樣品活性測(cè)定
1． 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent D）
3． 加入xx微升YIJI底物液（Reagent E）
4． 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
5． 加入50微升待測(cè)樣品（注意：100微克微粒體蛋白；樣品須溶解；參見注意事項(xiàng)10）
6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
7． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品活性讀數(shù)：550波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘－550波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘
五、計(jì)算樣品活性
注意事項(xiàng)
1． 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對(duì)照
2． 操作時(shí)，須戴手套
3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測(cè)定只需1次
4． 樣品須澄清，至關(guān)重要
5． 加入樣品啟動(dòng)反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻比色測(cè)定
6． 分光光度計(jì)波長(zhǎng)嚴(yán)格設(shè)置在550nm，誤差10nm將不產(chǎn)生信號(hào)
7． 測(cè)定值由低到高變化；測(cè)定可以持續(xù)5分鐘
8． 測(cè)定值由低到高變化，即5分鐘測(cè)定讀數(shù)高于0分鐘測(cè)定讀數(shù)，表明有酶活性
9． 比色測(cè)定后，比色皿須清洗*
10． 建議待測(cè)樣本為微粒體，其蛋白濃度為100微克/50微升；待測(cè)樣本為細(xì)胞裂解懸液，其總蛋白濃度為250至500微克/50微升（本公司提供 YIJI BCA蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30031.1）
11． 如果待測(cè)樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
12． NADPH細(xì)胞色素C還原酶單位活性定義為：在30℃，pH 7.8條件下，每分鐘內(nèi)能夠還原1微摩爾細(xì)胞色素C所需的酶量作為一個(gè)活性單位
13． 本公司提供系列NADPH細(xì)胞色素C還原酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感
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