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細胞/組織過氧化物體（peroxisome）粗提分離試劑盒
點擊次數(shù)：537 發(fā)布時間：2014-11-24
YIJI細胞/組織過氧化物體（peroxisome）粗提分離試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）
主要用途
YIJI細胞/組織過氧化物體（peroxisome）粗提分離試劑是一種旨在從動物細胞或組織中分離出完整而純化的過氧化物體細胞器的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。適合于動物軟組織（肝或腦組織）和培養(yǎng)細胞的過氧化物體的制備。其制備物產(chǎn)量高，可以被用于脂質(zhì)β-氧化、氨基酸代謝、糖脂和膽汁酸生物合成、蛋白組學(xué)和病理生理學(xué)等的研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩(wěn)定，分離產(chǎn)量和純度堪稱同類產(chǎn)品*。
技術(shù)背景
過氧化物體（peroxisome）細胞器在大多數(shù)真核和原核細胞中普遍存在，為異質(zhì)性（heterogenous）球狀顆粒（spherical particle），0.2至1微米直徑，含有70多種蛋白，主要為酶蛋白。在哺乳動物的肝和腎臟中zui為豐富。一旦過氧化物體異常，將導(dǎo)致澤爾韋格（Zellweger）綜合征。從任何組織或細胞分離過氧化物體的技術(shù)方法基本上采用：*，通過機械或化學(xué)方法破裂細胞；第二，通過低速差速離心去除殘渣碎屑和巨大細胞器；第三，通過高速差速離心獲得過氧化物體；甚至，第四，可以通過等密度離心獲得純度更高的過氧化物體。
產(chǎn)品內(nèi)容
YIJI清理液（Reagent A） 毫升
YIJI裂解液（Reagent B） 毫升
YIJI凈化液（Reagent C） 毫升
YIJI強化液（Reagent D） 毫升
YIJI保存液（Reagent E） 毫升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存YIJI凈化液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月
用戶自備
HANK平衡鹽緩沖溶液（GMS12028）或PBS緩沖溶液（GMS12033）：用于清理細胞
*乙二安四乙酸混合液（GMS12024）：用于細胞脫離
*細胞培養(yǎng)液（GMS12052）：用于細胞處理所需的培養(yǎng)基
15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器
4℃臺式離心機：用于樣品操作
4℃超速離心機：用于樣品操作
DOUNCE勻漿器：用于裂解細胞
實驗步驟
- 動物軟組織過氧化物體分離（組織勻漿法）
實驗開始前，將－20℃冰箱里的YIJI凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出xx毫升YIJI凈化液（Reagent C）和xx毫升的YIJI裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為YIJI裂解工作液，放進冰槽里備用。然后進行下列操作。
- 手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定1克組織重量（實驗前使動物空腹12至24小時）
- （選擇步驟）放進預(yù)冷的50毫升錐形離心管
- （選擇步驟）加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A）清洗1次
- 即刻用刀片切碎組織
- 放進一個預(yù)冷的15毫升錐形離心管
- 加入xx毫升預(yù)冷的YIJI裂解工作液
- 渦旋震蕩5秒，充分混勻
- 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
- 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約20至40下）（注意：參見注意事項8）
- 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
- 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g
- 小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
- 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為3500g
- 小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管
- 放進4℃超速離心機離心20分鐘，速度為25000g
- 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得過氧化物體沉淀物
- （選擇步驟）加入xx毫升預(yù)冷的YIJI保存液（Reagent E）
- （選擇步驟）放進4℃超速離心機再次離心10分鐘，速度為25000g
- （選擇步驟）小心抽去上清液
- 加入xx毫升YIJI保存液（Reagent E），充分混勻
- 即刻移入1.5毫升離心管，放進－70℃冰箱里
二、動物軟組織過氧化物體分離（化學(xué)處理法）
實驗開始前，將－20℃冰箱里的YIJI凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出xx毫升YIJI凈化液（Reagent C）和xx毫升的YIJI裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為YIJI裂解工作液，放進冰槽里備用。然后進行下列操作。
- 手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定1克組織重量（實驗前使動物空腹12至24小時）
- （選擇步驟）放進預(yù)冷的50毫升錐形離心管
- （選擇步驟）加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A）清洗1次
- 移入一個液氮凍存管
- 即刻放入液氮罐過夜
- 次日從液氮罐里取出，即刻（zui快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）
- 放進一個15毫升錐形離心管
- 加入xx毫升預(yù)冷的YIJI裂解工作液
- 渦旋震蕩5秒，充分混勻
- 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
- 加入xx微升預(yù)冷的YIJI強化液（Reagent D）
- 渦旋震蕩5秒，充分混勻
- 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項9）
- 加入xx毫升預(yù)冷的YIJI保存液（Reagent E），輕輕搖動試管混勻
- 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
- 小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
- 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為3500g
- 小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管
- 放進4℃超速離心機離心20分鐘，速度為25000g
- 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得過氧化物體沉淀物
- （選擇步驟）加入xx毫升預(yù)冷的YIJI保存液（Reagent E）
- （選擇步驟）放進4℃超速離心機再次離心10分鐘，速度為25000g
- （選擇步驟）小心抽去上清液
- 加入xx毫升YIJI保存液（Reagent E），充分混勻
- 即刻移入1.5毫升離心管，放進－70℃冰箱里
三、動物細胞過氧化物體分離（細胞勻漿法）
實驗開始前，將－20℃冰箱里的YIJI凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出xx毫升YIJI凈化液（Reagent C）和xx毫升的YIJI裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為YIJI裂解工作液，放進冰槽里備用。然后進行下列操作。
- 準(zhǔn)備5至10瓶75cm2細胞培養(yǎng)瓶的細胞（5 X 107），直至細胞生長鋪滿整個培養(yǎng)表面
- 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去
- 重復(fù)實驗步驟2一次
- 加入3毫升用戶自備的*乙二安四乙酸混合液，鋪滿整個細胞生長表面
- 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
- 輕輕手擊震動培養(yǎng)瓶，使細胞脫落，
- 分別加入10毫升用戶自備的*細胞培養(yǎng)液
- 移入一個50毫升錐形離心管
- 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為200g
- 小心抽去上清液
- 加入xx毫升預(yù)冷的YIJI清理液（Reagent A），混勻細胞
- 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
- 小心抽去上清液
- 加入xx毫升預(yù)冷的YIJI裂解工作液
- 渦旋震蕩5秒，充分混勻細胞顆粒群
- 即刻放進預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
- 在冰槽里用勻漿棒勻化細胞（約20至40下）（注意：參見注意事項8）
- 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
- 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g
- 小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
- 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為3500g
- 小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管
- 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為25000g
- 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得過氧化物體沉淀物
- （選擇步驟）加入xx毫升預(yù)冷的YIJI保存液（Reagent E）
- （選擇步驟）放進4℃超速離心機再次離心10分鐘，速度為25000g
- （選擇步驟）小心抽去上清液
- 加入xx毫升YIJI保存液（Reagent E），充分混勻
- 即刻移入1.5毫升離心管，放進－70℃冰箱里
四、動物細胞過氧化物體分離（化學(xué)處理法）
實驗開始前，將－20℃冰箱里的YIJI凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出xx毫升YIJI凈化液（Reagent C）和xx毫升的YIJI裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為YIJI裂解工作液，放進冰槽里備用。然后進行下列操作。
- 準(zhǔn)備5至10瓶75cm2細胞培養(yǎng)瓶的細胞（5 X 107），直至細胞生長鋪滿整個培養(yǎng)表面
- 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去
- 重復(fù)實驗步驟2一次
- 加入3毫升用戶自備的*乙二安四乙酸混合液，鋪滿整個細胞生長表面
- 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
- 輕輕手擊震動培養(yǎng)瓶，使細胞脫落
- 分別加入10毫升用戶自備的*細胞培養(yǎng)液
- 移入一個50毫升錐形離心管
- 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為200g
- 小心抽去上清液
- 加入xx毫升預(yù)冷的YIJI清理液（Reagent A）
- 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
- 小心抽去上清液
- 加入xx毫升預(yù)冷的YIJI裂解工作液
- 渦旋震蕩5秒，充分混勻
- 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
- 加入xx微升預(yù)冷的YIJI強化液（Reagent D）
- 渦旋震蕩5秒，充分混勻
- 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項9）
- 加入xx毫升預(yù)冷的YIJI保存液（Reagent E），輕輕搖動試管混勻
- 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g
- 小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
- 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為3500g
- 小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管
- 放進4℃超速離心機離心20分鐘，速度為25000g
- 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得過氧化物體沉淀物
- （選擇步驟）加入xx毫升預(yù)冷的YIJI保存液（Reagent E）
- （選擇步驟）放進4℃超速離心機再次離心10分鐘，速度為25000g
- （選擇步驟）小心抽去上清液
- 加入1毫升YIJI保存液（Reagent E），充分混勻
- 即刻移入1.5毫升離心管，放進－70℃冰箱里
注意事項
- 本產(chǎn)品為10次（1克動物組織或5 X 107細胞）或50次（200毫克動物組織或1 X 107細胞）操作
- 實際操作的動物組織重量或細胞量與試劑使用量按比例調(diào)整：例如200毫克動物組織：試劑用量是標(biāo)準(zhǔn)用量的五分之一
- 所有操作均須嚴(yán)格在4℃或以下狀態(tài)進行
- 操作時，須戴手套
- 操作時，須無菌操作，避免污染母液，尤其是YIJI裂解液（Reagent B）和YIJI保存液（Reagent E）
- 建議使用足夠的樣品量
- 建議嚴(yán)格控制操作時間
- 通常勻化次數(shù)為20至40下（或細胞顆粒群/組織塊狀消失為止）達到80％的細胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織或細胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細胞裂解程度：完整細胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)
- 通常孵育5分鐘（不宜超過5分鐘）達到80％的細胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織或細胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升裂解物的細胞裂解程度：完整細胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加孵育時間和渦旋震蕩次數(shù)
- 可見離心后出現(xiàn)的液面頂端的白色脂肪漂浮層，使用吸管或qiang頭小心吸掉
- 對于難以裂解的細胞，例如HeLa細胞，采用物理勻漿法是優(yōu)先推薦的技術(shù)處理
- 通常1克動物組織或5 X 107細胞的過氧化物體含量為1毫克以上過氧化物體蛋白
13． 如果需要獲得99％以上純度的過氧化物體，使用YIJI細胞/組織高質(zhì)純化過氧化物體分離試劑盒－YIJI10119.3
- 過氧化物體正常活性測定方法是： CTALASE、HYDROXYPYRUVATE REDUCTASE等
- 本公司提供系列過氧化物體分析試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的過氧化物體內(nèi)外膜完整
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的過氧化物體維持正?；钚?/span>
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶
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