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YIJI 細(xì)胞 NADPH 氧化酶活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書（中文版）

主要用途

YIJI 細(xì)胞 NADPH 氧化酶活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在使用特異性抑制劑，通過(guò)反應(yīng)系統(tǒng)測(cè)定

樣品中還原型*腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化后峰值的降低，即采用比色法測(cè)定樣品中酶活性

的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種細(xì)胞樣品（動(dòng)

物或人體）還原型*腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH 氧化酶）的特異活性檢測(cè)。用于免疫、血

液研究、蛋白組學(xué)、病理生理學(xué)等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能

穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測(cè)敏感。

技術(shù)背景

NADPH氧化酶，通常稱為還原型*腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（reduced nicotinamide adenine

dinucleotide phosphate oxidase；NADPH oxidase；EC1.6.3.1）或還原型輔酶II氧化酶，是機(jī)體防御機(jī)制中的

重要元素。NADPH氧化酶由6個(gè)亞體構(gòu)成：Rho GTP酶（Rho guanosine triphosphatase）和5個(gè)phox（吞噬細(xì)

胞氧化酶；phagocytic oxidase） 其中主要包含細(xì)胞膜嵌合蛋白質(zhì)分子。（gp91phox、p22phox、flavocytochrome

b558等），以及位在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)分子（p47phox、p67phox、p40phox、Rac1、Rac2等）。其zui特征性的

酶活性是超氧化物歧化酶敏感的還原型*腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶。細(xì)胞膜上的NADPH氧化酶被激

活，將還原型輔酶Ⅱ（NADPH）轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸洼o酶Ⅱ（NADP），氧分子則獲得電子形成超氧陰離子O2-，

由O2-又可生成H2O2和OH－。其超氧陰離子產(chǎn)物具有殺死微生物的功能。NADPH氧化酶異常將導(dǎo)致慢性肉

芽腫?。–hronic Granulomatous Disease；CGD）?；诘孜镞€原型*腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），

在特異性抑制劑聯(lián)苯基三價(jià)碘（diphenyleneiodonium；DPI）的存在下，受到NADPH氧化酶的催化作用，

轉(zhuǎn)化為氧化型*腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP），產(chǎn)生吸光峰值的變化，通過(guò)分光光度儀（340nm波長(zhǎng)）

檢測(cè)，來(lái)測(cè)定NADPH氧化酶的特異活性。其反應(yīng)方式為：

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI 清理液（Reagent A）

YIJI 裂解液（Reagent B）

YIJI 緩沖液（Reagent C）

YIJI 反應(yīng)液（Reagent D）

YIJI 陰性液（Reagent E）

YIJI 底物液（Reagent F）

YIJI 專性液（Reagent G）

產(chǎn)品說(shuō)明書

毫升

毫升

毫升

毫升

毫升

微升

微升

1份

保存方式

1

保存 YIJI 清理液（Reagent A） YIJI 陰性液和（Reagent E） 4℃冰箱里，在其余的保存在在－20℃

冰箱里，避免反復(fù)凍融；YIJI 反應(yīng)液（Reagent D）和 YIJI 底物液（Reagent F），避免光照，有

效保證 6 月

用戶自備

15 毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5 毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于貼壁細(xì)胞脫離

4℃（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品處理

恒溫培養(yǎng)箱或恒溫水槽：用于反應(yīng)物孵育

比色皿：用于比色測(cè)定的容器

分光光度儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；YIJI 反應(yīng)液（Reagent D）和

YIJI 底物液（Reagent F）注意避光。然后進(jìn)行下列操作。

一、樣品準(zhǔn)備

準(zhǔn)備好 25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或 60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1 至 5 X 106細(xì)胞）

小心加入 xx 毫升 YIJI 清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面

小心抽去清理液

使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用*消化）

加入 xx 毫升 YIJI 清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞

移入到預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開(kāi)始）

放進(jìn) 4℃臺(tái)式離心機(jī)離心 5 分鐘，速度為 300g

小心抽去上清液

加入 xx 微升 YIJI 裂解液（Reagent B），充分混勻

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10. 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的 1.5 毫升離心管

11. 強(qiáng)力渦旋震蕩 15 秒

12. 置于冰槽里孵育 30 分鐘

13. 放進(jìn) 4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心 5 分鐘，速度為 16000g（或 13000RPM，例如 eppendorf 5415）

14. 小心移取 500 微升上清液到新的預(yù)冷的 1.5 毫升離心管

15. 移取 10 微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 YIJI Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－

GMS30030.1）

16. 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、測(cè)定準(zhǔn)備

1． 從-70℃取出待測(cè)樣品（例如細(xì)胞裂解懸液樣品等），置于冰槽里

2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為 30℃）：波長(zhǎng)為 340nm，間隔 60 秒，讀數(shù) 6 次（共 5 分鐘），并置零

2

三、 背景對(duì)照測(cè)定

1． 移取 xx 微升 YIJI 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升 YIJI 反應(yīng)液（Reagent D）

3． 加入 xx 微升 YIJI 底物液（Reagent F）

4． 放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里靜置 3 分鐘

5． 加入 xx 微升 YIJI 陰性液（Reagent E）

6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)）

7． 即刻放入分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照：（340 波長(zhǎng)讀數(shù)）0 分鐘－（340 讀數(shù)）5 分鐘

四、 樣品總活性測(cè)定

移取 xx 微升 YIJI 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

加入 xx 微升 YIJI 反應(yīng)液（Reagent D）

加入 xx 微升 YIJI 底物液（Reagent F）

放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里靜置 3 分鐘

加入 100 微升待測(cè)樣品（注意：50 至 100 微克細(xì)胞裂解懸液蛋白；樣品須溶解；參見(jiàn)注意事項(xiàng) 5、11

1.

2.

3.

4.

5.

和 12）

6.

7.

上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)）

即刻放入分光光度儀檢測(cè)，此為樣品總活性讀數(shù)：（340 波長(zhǎng)讀數(shù)）0 分鐘－（340 讀數(shù)）5 分鐘

五、 樣品非特異活性測(cè)定

1． 移取 xx 微升 YIJI 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升 YIJI 反應(yīng)液（Reagent D）

3． 加入 xx 微升 YIJI 專性液（Reagent G）

4． 加入 100 微升待測(cè)樣品（注意：50 至 100 微克細(xì)胞裂解懸液蛋白；樣品須溶解；參見(jiàn)注意事項(xiàng) 5、11

和 12）

5． 放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里靜置 3 分鐘

6． 加入 xx 微升 YIJI 底物液（Reagent F）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)）

8． 即刻放入分光光度儀檢測(cè)，此為樣品非特異活性讀數(shù)：（340 波長(zhǎng)讀數(shù)）0 分鐘－（340 讀數(shù)）5 分鐘

六、 計(jì)算樣品活性

1）樣品總活性

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.1（樣品容量，毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 5（分鐘）]

＝單位/毫升或微摩爾 NADPH/分鐘/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克＝單位/毫克或微摩爾

NADPH/分鐘/毫克

或者

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.1（樣品重量，毫克）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 5（分鐘）]

＝單位/毫克＝微摩爾 NADPH/分鐘/毫克

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