細(xì)胞酪氨酸酶（tyrosinase）活性比色法定量檢測(cè)試劑盒
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)
主要用途
細(xì)胞酪氨酸酶（tyrosinase）活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)酪氨酸酶反應(yīng)系統(tǒng)中底物酪氨酸氧化
后，產(chǎn)生多巴色素，呈現(xiàn)吸光峰值的變化，即采用比色法來(lái)測(cè)定細(xì)胞裂解懸液樣品中酶活性的而經(jīng)典
的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種人體和動(dòng)物細(xì)胞，尤其是黑色素細(xì)胞
和黑色素瘤細(xì)胞裂解懸液樣品中酪氨酸酶的活性檢測(cè)，以及抑制劑篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作
簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。
技術(shù)背景
酪氨酸酶（tyrosinase；EC1.14.18.1）是一種單酚單加氧酶（monophenol monooxygenase），又稱為單酚酶
（monophenolase）或單酚二羥基苯丙氨酸：O2 氧化還原酶（monophenol dihydroxyphenylalanin：O2
oxidoreductase），具有雙功能的含銅糖蛋白，廣泛存在于植物、酵母和動(dòng)物組織中，其蛋白結(jié)構(gòu)、大小、
糖基化方式、激活特征等都不同。人體酪氨酸酶是一個(gè)跨膜蛋白，而催化結(jié)構(gòu)域在黑色素細(xì)胞（melanocyte）
或色素細(xì)胞的黑色素器（melanosome）里。酪氨酸酶通過(guò)催化L-酪氨酸（L-tyrosine）等的o-羥基化
（o-hydroxylation）反應(yīng)變成L-多巴（L-dopamine），進(jìn)而氧化產(chǎn)生黑色素底物多巴醌（dopaquinone），
從而由多巴色素（dopachrome）轉(zhuǎn)化為黑色素（melanin）中的真黑素（eumelanin），以及其它色素，包括
毛發(fā)和眼睛色素。紫外線可以激活酪氨酸酶活性，嚴(yán)重時(shí)，會(huì)引起色素沉著（hyperpigmentation）。酪氨酸
酶基因突變將導(dǎo)致I 型眼皮膚白化病（oculocutaneous albinism）。酪氨酸酶抑制劑成為增白化妝品的重要
元素?；诘孜锢野彼?，在酪氨酸酶的催化下，產(chǎn)生多巴色素，通過(guò)其吸光值的變化（475nm 波長(zhǎng)），來(lái)定
量測(cè)定酪氨酸酶的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
緩沖液（Reagent C） 毫升
底物液（Reagent D） 毫升
陰性液（Reagent E） 微升
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)1 份
保存方式
保存裂解液（Reagent B）和底物液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent
D）避免光照，有效保證6 月
2
用戶自備
1.5 毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器
15 毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
細(xì)胞刮脫棒：用于細(xì)胞脫離
微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備
比色皿或酶標(biāo)板：用于比色的容器
分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析
實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑置入冰槽里融化。底物液（Reagent D）避免光照。然后進(jìn)
行下列操作。
一、樣品準(zhǔn)備
1． 準(zhǔn)備好25cm2 細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1 至5 X 106 細(xì)胞）
2． 小心加入xx 毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面
3． 小心抽去清理液
4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）
5． 加入xx 毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
6． 移入到預(yù)冷的15 毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開(kāi)始）
7． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5 分鐘，速度為300g
8． 小心抽去上清液
9． 加入xx 微升裂解液（Reagent B），充分混勻
10．轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5 毫升離心管
11．強(qiáng)力渦旋震蕩15 秒
12．置于冰槽里孵育30 分鐘
13．放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5 分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14．小心移取500 微升上清液到新的預(yù)冷的1.5 毫升離心管
15．移取10 微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)
16．即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
二、測(cè)定準(zhǔn)備
1. 準(zhǔn)備好上述待測(cè)樣品，置于冰槽里
2. 設(shè)定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長(zhǎng)475nm
3. 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
三、背景對(duì)照測(cè)定
1． 移取xx 微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx 微升底物液（Reagent D）
3． 充入氧氣2 分鐘
4． 加入xx 微升陰性液（Reagent E）
3
5． 上下傾倒數(shù)次，混勻
6． 室溫下（25℃）孵育60 分鐘
7． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景讀數(shù)
四、樣品測(cè)定
1. 移取xx 微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2. 加入xx 微升底物液（Reagent D）
3. 充入氧氣2 分鐘
4. 加入50 微升待測(cè)樣品（注意：50 微克蛋白總量）
5. 上下傾倒數(shù)次，混勻
6. 室溫下（25℃）孵育60 分鐘
7. 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)
五、計(jì)算樣品活性
六、酶標(biāo)板測(cè)定
1． 在96 孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
2． 分別移取xx 微升緩沖液（Reagent C）到所有孔中
3． 分別加入xx 微升底物液（Reagent D）
4． 充入氧氣2 分鐘
5． 分別加入xx 微升陰性液（Reagent E）或待測(cè)樣品（50 微克蛋白總量）
6． 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板
7． 室溫下（25℃）孵育60 分鐘
8． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)，獲得背景和樣品讀數(shù)
9． 活性計(jì)算
注意事項(xiàng)
1． 本產(chǎn)品為20 次（比色皿）和80 次（酶標(biāo)板）操作，包括背景對(duì)照
2． 操作時(shí)，須戴手套
3． 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1 次
4． 測(cè)定值由低到高變化；測(cè)定持續(xù)60 分鐘
5． 比色測(cè)定后，比色皿須清洗*
6． 樣本讀數(shù)高于背景讀數(shù)表明具有酶活性
7． 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50 微克/50 微升；如果樣本酶活性過(guò)低或過(guò)高， 則可以增加或降低樣本量
8． 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
9． 可以使用酪氨酸酶抑制劑曲酸（Kojic acid）作為抑制劑對(duì)照或陰性對(duì)照
10．酪氨酸酶單位活性定義為：在25℃，pH 6.8 條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化產(chǎn)生1 微摩爾多巴色素所需的
4
酶量作為一個(gè)活性單位
11．本公司提供系列酪氨酸酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感