本試劑盒僅供研究使用
 
預(yù)期應(yīng)用
ELISA法定量測(cè)定豬血清、細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中TM含量。
實(shí)驗(yàn)原理
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測(cè)定標(biāo)本中TM水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入TM抗原、生物素化的抗豬TM抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的TM呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。
試劑盒組成
1. 酶聯(lián)板：一塊（96孔）
2. 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為10 ng/mL，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成10 ng/mL，5 ng/mL ，2.5 ng/mL，1.25 ng/mL，0.62 ng/mL，0.31 ng/mL，0.16 ng/mL，其原液直接作為zui高標(biāo)準(zhǔn)濃度，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/mL，臨用前15分鐘內(nèi)配制。
如配制5 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml 10 ng/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3. 樣品稀釋液：1×20ml/瓶。
4. 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml/瓶。
5. 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml/瓶。
6. 檢測(cè)溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以抗體稀釋液A1：100稀釋。
7. 檢測(cè)溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以抗體稀釋液B1：100稀釋。
8. 底物溶液：1×10ml/瓶。
9. 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10. 終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
標(biāo)本的采集及保存
1．細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請(qǐng)離心后收集上清，并將標(biāo)本保存于-20℃，且應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2．血清：標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注：標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。
4. 組織勻漿: 將動(dòng)物的組織標(biāo)本先用PBS洗滌,去除多余血液,勻漿化后放在20mlPBS中于-20° C放置過夜,第二天,經(jīng)過二次反復(fù)凍融破膜,將勻漿物5000x g離心5分鐘,取上清即可檢測(cè)。
操作步驟
各試劑在使用前平衡至室溫。
1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測(cè)樣品100ul，輕輕混勻，37℃，120分鐘。
2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。
3. 每孔加檢測(cè)溶液A工作液 100ul，37℃,60分鐘。洗板3次，350ul/每孔，甩干。
4. 每孔加檢測(cè)溶液B工作液 100ul，37℃，60分鐘，洗板5次，甩干。
5. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色30分鐘。
6. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)。用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。
注：
1． 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零。
2．為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層
吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
    自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。
特異性
    本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)重組或天然的豬TM，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。
計(jì)算
  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。
注意事項(xiàng)
1． 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
2． 一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
3． 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。
4． 如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過高，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以稀釋倍數(shù)。
5．在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液工作液時(shí)，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。
6．底物請(qǐng)避光保存。

說明
1. 在儲(chǔ)存及孵育過程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染，試劑避免受到微生物的污染，因?yàn)榈鞍姿饷傅母蓴_將導(dǎo)致出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果。
2. 小心吸取試劑并嚴(yán)格遵守給定的孵育時(shí)間和溫度。請(qǐng)注意在吸取標(biāo)本 / 標(biāo)準(zhǔn)品，酶結(jié)合物或底物時(shí)，*個(gè)孔與zui后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大，將會(huì)導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育”時(shí)間，從而明顯地影響到測(cè)量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。而且，洗滌不充分將影響試驗(yàn)結(jié)果。
3. 試劑盒保存：部分試劑保存于-20℃，部分試劑保存于2-8℃，具體以標(biāo)簽上的標(biāo)示為準(zhǔn)。
4. 濃洗滌液會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。
5. 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。
6. 中、英文說明書可能會(huì)有不一致之處，請(qǐng)以英文說明書為準(zhǔn)。
7. 所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測(cè)裝置。
8. 有效期：6個(gè)月