重組DNA分子電轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞
實(shí)驗(yàn)原理
宿主細(xì)胞是基因克隆載體的增殖場所，對于一個適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，具有以下幾個要求：
1、對載體的復(fù)制和擴(kuò)增沒有嚴(yán)格的限制。
2、不存在特異的內(nèi)切酶體系降解載體DNA。
3、載體增殖過程中，不對載體DNA進(jìn)行修飾。
4、不會生產(chǎn)載體DNA的體內(nèi)重組。
5、容易導(dǎo)入重組DNA分子。
6、符合“重組DNA操作規(guī)則”的安全標(biāo)準(zhǔn)。
現(xiàn)在常規(guī)使用的是大腸肝菌XL1-Blue株K12株。本實(shí)驗(yàn)用XL1-Blue株。
試劑和器材
備用平板，冰盒，20uL槍，未開蓋的新槍頭盒。
重組DNA。
氨芐青酶素（AP）。
二甲苯甲酰胺（X-gal 20mg/mL，溶于二甲苯甲酰胺，無須濾過滅菌，分裝小包裝避光貯存于—20℃）。
IPTG。
XL1-Blue電擊細(xì)胞。
操作方法
1、鋪備用平板
LB固體培養(yǎng)基200mL，融化后加200uL。→凝固后約半小時，加入X-gal 80uL和IPTG 9uL。→涂布，37℃，約1h。→得備用平板。
2、電擊轉(zhuǎn)化
電擊法依靠短暫的電擊，促使DNA進(jìn)入細(xì)菌。—70℃冰箱取電擊細(xì)胞XL1-Blue，冰上解凍。→取2uL重組DNA或鏈接產(chǎn)物于40uL電擊細(xì)胞中，混勻。→在電擊儀上將重組DNA分子轉(zhuǎn)入XL1-Blue細(xì)胞。→恢復(fù)生長約半小時。→1200r/min，2～3min。→去掉大部分上清，剩200～300uL，用槍吹打混勻。→涂布備用平板。→37℃，培養(yǎng)過夜。→挑白色菌落。
會員1.png)