Ets轉(zhuǎn)錄因子家族e(cuò)ts1抗體

Western bloting的操作（間接法）
1、        蛋白質(zhì)樣品（抗原）的制備：
①  細(xì)胞的處理方法：向收集到的細(xì)胞中加入RIPA裂解緩沖液（三中蛋白酶抑制在使用前加入，終濃度為2ug/ml）在冰上裂解30—60min，然后再插入冰盒進(jìn)行超聲，超聲強(qiáng)度以不產(chǎn)生泡沫為準(zhǔn)，超聲每次2-3秒，重復(fù)3-4次，再離心12000rpm3-5min，吸取上清備用。（超聲強(qiáng)度不能過大，防止蛋白碳化）
組織的處理方法：按實(shí)驗(yàn)要求將組織從動(dòng)物體內(nèi)取出（樣品不宜反復(fù)凍融），取少量（1-2g左右）放入玻璃勻槳器中研磨成勻漿，然后轉(zhuǎn)入EP管中進(jìn)行超聲，超聲強(qiáng)度以不產(chǎn)生泡沫為準(zhǔn)，超聲每次5-7秒，重復(fù)5-6次，再離心12000rpm3-5min，吸取上清備用。
②上述兩種方法得來的樣品處理液還要加入1/4體積左右的上樣Buffer，然后放在沸水浴中加熱3-4min使蛋白變性，方可作為樣品點(diǎn)樣。（注意：在加熱組織裂解液時(shí)，肝臟和腎臟組織要特別注意其本身濃度，是在制作裂解液時(shí)就適當(dāng)稀釋，否則加熱后會(huì)凝結(jié)成固態(tài)。還有些組織處理后很粘稠，有帶絲狀物，這是未裂解的核酸，可以適當(dāng)離心后再用。）
2、        SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS－PAGE）
①根據(jù)要求配制好SDS-聚丙烯酸胺凝膠（一般釆用10%的SDS－PAGE）
②將已配制好的凝膠裝入電泳儀中（注意不要漏液）。
③設(shè)計(jì)加樣順序，作好實(shí)驗(yàn)記錄，按預(yù)定順序加樣。一般裂解液我們按10-20ul/道點(diǎn)樣，重組蛋白按1-2ug/道點(diǎn)樣。
④把電泳裝置與電源連接好，將電壓調(diào)至100V電泳10-20min，待溴酚藍(lán)遷移出積層膠位置再換用200V，30-40min后關(guān)閉電源。
⑤從電泳裝置上卸下凝膠玻璃板，用水沖洗干凈，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜。
4．轉(zhuǎn)膜（濕轉(zhuǎn)）
① 將凝膠玻璃板置于盛有電泳轉(zhuǎn)移緩沖液的容器中，浸泡幾分鐘。
② 帶上手套，準(zhǔn)備好濾紙和NC膜（83mm×75mm），盡量避免污染濾紙和膜，將裁減好的濾紙和膜浸泡與電泳轉(zhuǎn)移緩沖液中，驅(qū)除留于膜上的氣泡。
③ 打開轉(zhuǎn)移盒并放置淺盤中，用轉(zhuǎn)移緩沖液將海綿墊*浸透后將其放在轉(zhuǎn)移盒壁上，海綿上再放置一張浸濕的濾紙。
④ 按“海綿—濾紙—凝膠—NC膜—濾紙—海綿”的順序裝置好（注意不能有氣泡且裝置電極槽不能放反） Ets轉(zhuǎn)錄因子家族e(cuò)ts1抗體 
⑤將冰盒裝入緩沖液槽，注滿4℃預(yù)冷的轉(zhuǎn)移緩沖液。
⑥將整個(gè)裝置放在冰浴中用磁力攪拌器攪拌，連接好轉(zhuǎn)移電極恒流300mA轉(zhuǎn)移90min。電轉(zhuǎn)完畢后，將NC膜作好記號(hào)置于5%的脫脂奶粉（PBS配制）中封閉，37℃2小時(shí)或4℃過夜。
5．加一抗與抗原結(jié)合
①將加樣槽洗滌干凈，將膜用一次性手套覆蓋好，按標(biāo)記和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)切下膜條并作好記號(hào)，按順序置于加樣槽中加入相應(yīng)的一抗約1ml，注意保證膜的所有部分同溶液接觸。
②室溫下于搖床孵育2h或4℃過夜。
③棄去一抗，膜條仍置于加樣槽，每個(gè)槽中的膜用PBST在搖床洗滌洗滌5min左右 ，換液，反復(fù)4-5次。
6．加二抗與一抗的結(jié)合
① 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要和設(shè)計(jì)選擇合適的酶標(biāo)二抗和稀釋濃度（PBS稀釋），每個(gè)加樣槽中加入二抗1ml左右室溫下于搖床孵育1h，注意保證膜的所有部分同溶液接觸。
②棄去二抗，膜條仍置于加樣槽，每個(gè)槽加PBST在搖床洗滌洗滌5min左右，換液反復(fù)4-5次。
7．顯色反應(yīng)（重組蛋白一般用AP顯色或是DAB顯色，裂解液一般用發(fā)光法）
① HRP標(biāo)記二抗用DAB顯色，按順序依次將DAB三種劑各取3滴于5ml蒸餾水中，避光混勻，將膜加入顯色液中避光顯色5-15min終止反應(yīng)，對(duì)照Marker記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將NC膜晾干掃描保存
②        AKP標(biāo)記二抗用AP顯色，在10mlAKP緩沖液中加入66µlNBT溶液和33µl BCIP溶液混勻，室溫下將膜放入顯色（37℃可加速反應(yīng)）5-15min。對(duì)照Marker記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將NC膜晾干掃描保存。
③底物發(fā)光法：將兩種顯色底物1：1等體積混合后將其覆蓋在膜表面使其均勻，用玻璃膠片把膜包起來，馬上在暗室中將X光片覆蓋在膜的上面（時(shí)間根據(jù)光的亮度來衡量），顯影、定影。（熒光在一段時(shí)間后會(huì)越來越弱要控制好時(shí)間）