覆蓋基因組所有位點(diǎn)，十分適用于二代測(cè)序和其他下游應(yīng)用

REPLI-g Single Cell Kit擴(kuò)增的DNA平均長(zhǎng)度大于10 kb，并且覆蓋所有基因組位點(diǎn)。該產(chǎn)品已經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，適用于二代測(cè)序、基于芯片技術(shù)的比較基因組雜交（aCGH）和real-time PCR應(yīng)用等多種下游分析。使用該產(chǎn)品無(wú)需單獨(dú)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，減少了手動(dòng)操作，獲得的產(chǎn)物長(zhǎng)度PCR方法更長(zhǎng)（參見(jiàn)"Next-generation sequencing using REPLI-g amplified DNA requires less hands-on time and generates more sequence information than PCR-based methods"）。用擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行二代測(cè)序，獲得高品質(zhì)結(jié)果。這表明該試劑盒的位點(diǎn)覆蓋率大，錯(cuò)配率低，其擴(kuò)增的DNA（甚至從單一細(xì)菌細(xì)胞中擴(kuò)增的DNA）能夠與純化獲得的基因組DNA相媲美（參見(jiàn)"Comparable NGS results"）。另有研究對(duì)人類常染色體和X染色體上的多個(gè)標(biāo)記物進(jìn)行了分析，三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)均顯示：基因組的所有位點(diǎn)被成功擴(kuò)增，沒(méi)有遺漏任何一個(gè)位點(diǎn)（參見(jiàn)"Complete genome coverage"）。

REPLI-g Single Cell Kit的表現(xiàn)優(yōu)于其他供應(yīng)商的試劑盒

其他供應(yīng)商的試劑盒基于PCR技術(shù)進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，獲得的產(chǎn)物片段較短，帶有PCR引物序列，可能影響下游應(yīng)用?；赑CR的全基因組擴(kuò)增容易出現(xiàn)錯(cuò)誤，會(huì)導(dǎo)致堿基對(duì)突變、STR的減少或增多，使用低保真Taq DNA聚合酶會(huì)導(dǎo)致位點(diǎn)缺失。相反，REPLI-g Single Cell Kit能夠進(jìn)行高度均一的全基因組擴(kuò)增，位點(diǎn)偏差小。對(duì)四個(gè)試劑盒進(jìn)行了檢測(cè)，其中兩個(gè)利用多重置換擴(kuò)增技術(shù)（包括REPLI-g Single Cell Kit），另外兩個(gè)利用PCR技術(shù)。采用單一細(xì)胞擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)方案對(duì)所有試劑盒進(jìn)行序列位點(diǎn)檢測(cè)。除REPLI-g Single Cell Kit外的其他供應(yīng)商的試劑盒都出現(xiàn)了位點(diǎn)的遺漏（參見(jiàn)"Unbiased DNA amplification from a single cell"）。

凱杰試劑盒REPLI-g Single Cell Kit (24)

Principle

REPLI-g Single Cell Kit含有REPLI-g sc Polymerase，這是一種優(yōu)化的新型高保真Phi 29聚合酶。該試劑盒采用多重置換擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增復(fù)雜的基因組DNA，溫和的堿孵育能夠避免DNA片段化，促進(jìn)對(duì)所有位點(diǎn)的無(wú)偏差擴(kuò)增。該試劑盒十分適用于分離的腫瘤細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞等單一細(xì)胞，能夠擴(kuò)增獲得高產(chǎn)量DNA（參見(jiàn)表1）。此外，該試劑盒還配有專用于鮮血或干血、新鮮或冷凍組織的實(shí)驗(yàn)方案，可用于多種研究樣本。常規(guī)DNA產(chǎn)量可達(dá)40 µg，對(duì)模板的起始量要求低，因此進(jìn)行后續(xù)遺傳分析時(shí)無(wú)需檢測(cè)DNA濃度。REPLI-g Single Cell Kit的擴(kuò)增產(chǎn)物平均長(zhǎng)度超過(guò)10 kb，且覆蓋所有位點(diǎn)，適合于多種應(yīng)用，包括二代測(cè)序、基于芯片技術(shù)的比較基因組雜交、焦磷酸測(cè)序和real-time PCR分析（參見(jiàn)表2）。

擴(kuò)增原理

REPLI-g Single Cell Kit采用等溫基因組擴(kuò)增技術(shù)，即多重置換擴(kuò)增（MDA）。六聚體與變性DNA隨機(jī)結(jié)合，然后在等溫條件下，在優(yōu)化的Phi 29聚合酶作用下，發(fā)生鏈置換合成反應(yīng)。每個(gè)置換后的單鏈作為模板，與引物結(jié)合，可擴(kuò)增獲得高產(chǎn)量DNA（參見(jiàn)"Multiple Displacement Amplification (MDA) technology"）。Phi 29聚合酶為噬菌體衍生酶，具有3'→5'引物外切酶活性（校正活性），其保真性是Taq DNA聚合酶的1000倍。Phi 29聚合酶在優(yōu)化的REPLI-g Single Cell緩沖液體系中，能夠輕松的打開(kāi)發(fā)卡結(jié)構(gòu)等二級(jí)結(jié)構(gòu)，因此可促進(jìn)擴(kuò)增時(shí)聚合酶正常工作?？蓴U(kuò)增獲得長(zhǎng)達(dá)100 kb的DNA片段（參見(jiàn)"Unbiased amplification with Phi 29 polymerase"）。

細(xì)胞裂解和DNA的堿變性 

基因組DNA在用于酶促擴(kuò)增反應(yīng)前必須經(jīng)過(guò)變性，而這一變性過(guò)程通常使用高溫或高pH值（強(qiáng)堿）孵育。REPLI-g Single Cell Kit采用溫和的堿孵育，在細(xì)胞裂解、DNA變性的同時(shí)，確保DNA片段化程度小，不產(chǎn)生堿基突變。因此擴(kuò)增獲得的DNA完整度高，產(chǎn)物長(zhǎng)度長(zhǎng)，覆蓋位點(diǎn)多（參見(jiàn)"Effect of heat and alkaline denaturation on loci representation"）。

高效去除可檢測(cè)到的DNA污染

REPLI-g Single Cell Kit中的所有組分都經(jīng)過(guò)了dute的去污染流程，避免擴(kuò)增產(chǎn)物被污染。在標(biāo)準(zhǔn)化流程中，對(duì)緩沖液和試劑進(jìn)行紫外線照射，確保其不會(huì)污染DNA（參見(jiàn)"Innovative decontamination procedure"）。紫外線照射后，對(duì)試劑盒的所有組分進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，確保其性能。

Procedure

簡(jiǎn)單的單管操作

REPLI-g Single Cell Kit可對(duì)單一細(xì)胞或有限的樣本進(jìn)行簡(jiǎn)便、可靠、準(zhǔn)確的全基因組擴(kuò)增。反應(yīng)體系構(gòu)建十分便利、可靠，僅需15分鐘左右的手動(dòng)操作（參見(jiàn)"REPLI-g Single Cell Kit procedure"）。專用的緩沖液和試劑可對(duì)單一細(xì)胞、有限的組織材料、或純化的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)量高、位點(diǎn)覆蓋率大（參見(jiàn)表3）。REPLI-g技術(shù)擴(kuò)增獲得的DNA可在–20°C長(zhǎng)期儲(chǔ)存（參見(jiàn)"Consistent long-term stability"）。請(qǐng)參見(jiàn)表4，了解REPLI-g產(chǎn)品線的更多信息。

Applications