蛋白質(zhì)內(nèi)在或相關(guān)酶活性的測(cè)定

時(shí)間：2012-9-19閱讀：707

因?yàn)槊庖叱恋淼牡鞍踪|(zhì)是在相對(duì)溫和的情況下制備的，所以zui終的蛋白質(zhì)復(fù)合物常保留有生物特征。例如，免疫沉淀的激酶還有識(shí)別并催化天然底物磷酸化的能力。這就使得一系列免疫沉淀方法不僅能檢測(cè)任何抗原的內(nèi)在酶活性，而且能檢測(cè)與抗原相關(guān)的任何蛋白質(zhì)的活性。

研究酶活性的技術(shù)路線

免疫沉淀的蛋白或蛋白復(fù)合物常保持有酶活性，在第三次洗滌之后，與微球結(jié)合的免疫復(fù)合物在反應(yīng)緩沖液中進(jìn)一步洗滌，zui后一次洗滌液正常情況下不含有底物，也可忽略ATP或其他能量來(lái)源。也會(huì)除去大部分的去污劑，如EDTA等可能封閉或減慢酶活性的物質(zhì)，免疫復(fù)合物和微球可再懸浮在反應(yīng)緩沖液中。

在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)要考慮以下幾點(diǎn)。*，要記住在這些處理過(guò)程中酶動(dòng)力學(xué)會(huì)有很大改變，酶仍然與微球結(jié)合，所以它們不能通過(guò)溶液擴(kuò)散，因此反應(yīng)會(huì)遵循基本的原理。第二，微球密度大會(huì)很快沉到管底，這就意味著要在反應(yīng)過(guò)程中搖動(dòng)相鄰的管子，更容易的是，可以在反應(yīng)過(guò)程中吹打管底，再懸浮微球。

有些方法可用來(lái)終止反應(yīng)。應(yīng)根據(jù)相鄰的步驟進(jìn)行正確的選擇，如果檢測(cè)放射活性物質(zhì)轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)底物的情況，如在蛋白激酶反應(yīng)中，ATP的[32p]丁磷酸轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)分子中，可通過(guò)加入樣本緩沖液終止反應(yīng)。此外，加熱反應(yīng)可阻止酶活性。其他一些方法包括將EDTA加入到雙價(jià)離子中（EDTA．Ca²⁺）或冷凍樣本。

將酶和微球結(jié)合可應(yīng)用于小量免疫親和純化，離心去除上清后即可使酶與底物分離。

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