免疫金銀染色方法敏感、簡(jiǎn)便、省時(shí)、安全可靠，葡萄球菌A蛋白（SPA）金標(biāo)記四步法是在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來的更為敏感的一種新方法。SPA和許多哺乳類動(dòng)物IgG具有親和性，且它們之間的連接不會(huì)干擾抗原—抗體的結(jié)合。簡(jiǎn)單的SPA金標(biāo)記二步法后，第三步用抗SPA與SPA金表面分子通過Fab或Fc段相結(jié)合，結(jié)果結(jié)合更多的膠體金顆粒，再通過銀增強(qiáng)，使原始信號(hào)得到幾何級(jí)放大，其染色原理見圖。
雙PAG免疫金銀染色原理
（一）染色流程：
（1）石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，0．05mol/L（pH7．4）TBS洗3×3min。
（2）0．1％*37℃消化20min，或抗原修復(fù)20min（98℃），自然冷卻至室溫。
（3）0.05mol/L（pH7.4） TBS洗3×3min。
（4）1%EA（卵蛋白）15min，不洗。
（5）適當(dāng)稀釋的特異抗體室溫4h或4℃孵育20h，或37C孵育30min。
（6）0．05mol/L（pH7．4）TBS洗3×5min。
（7）0．02mol/L（pH7．4）TBS（內(nèi)含0．1％BSA）洗10min。
（8）1％EA 15min，不洗，滴加PAGlonm 1：40稀釋，室溫1h，
（9）0．05mo!/L（pH7．4）TBS洗10min。
（10）兔抗SPAIgGl：400稀釋，37℃ 30min。
（11）0．05mol/L（pH7．4）TBS洗10min。
（12）滴加PAGlonm 1：60稀釋，室溫1h，或37℃ 30min。
（13）0．05mol/L（pH7．4）TBS洗10min。
（14）1％戊二醛洗10min。
（15）雙蒸水洗5min。
（16）1％明膠洗5min。
（17）銀避光顯影8～15min。
（18）雙蒸水洗15min。
（19）固定：用顯影定影液（1：4或1：10）固定5min，也可以用15％硫酸鈉—20％*混合液固定1～3rain，或用1％戊二醛固定5min，50℃溫水洗3～6min。
（20）襯染：核固紅襯染3min或甲基綠襯染3min。
（21）常規(guī)脫水，樹膠封片。
（22）鏡檢：陽性物質(zhì)呈黑色或黑褐色，顆粒分布于抗原—抗體反應(yīng)部位；背景較干凈，呈紅色。
（二）雙PAG法的敏感性
應(yīng)用本法對(duì)keratin、AFP、HBsAg、FN、SOD、HCG、F8、P53等組織抗原的定位，連續(xù)4gm石蠟切片，同時(shí)用IGSS和雙PAG法，不同的一抗稀釋度，結(jié)果雙PAG法要比IGSS法敏感5～8倍，抗體的稀釋度從1： （1000～5000）提高到1： （10000—50000），大大節(jié)約了*抗體。尤其組織細(xì)胞內(nèi)抗原性較弱，抗原丟失嚴(yán)重，應(yīng)用雙PAG法均能得到有效的檢測(cè)，陽性檢測(cè)率和陽性強(qiáng)度有了明顯的提高。某些抗原用單一的SPA金標(biāo)探針對(duì)某些抗原只能獲得低強(qiáng)度的染色，當(dāng)用雙PAG法時(shí)可獲得強(qiáng)的特異性染色。
