實(shí)驗(yàn)原理
醋酸纖維薄膜電泳是用醋酸纖維薄膜作為支持物的電泳方法。它具有簡便、快速、樣品用量少，應(yīng)用范圍廣，分離清晰，沒有吸附現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)。目前已廣泛用于血清 蛋白、脂蛋白、血紅蛋白、糖蛋白、多肽、核酸、同工酶及其他生物大分子的分析檢測，是醫(yī)學(xué)和臨床檢驗(yàn)的常規(guī)技術(shù)。
本實(shí)驗(yàn)以醋酸纖維素為電泳支持物，分離各種血清 蛋白。血清中含有白蛋白、α－球蛋白、β－球蛋白、γ－球蛋白和各種脂蛋白等。各種蛋白質(zhì)由于氨基酸 組成、分子量、等電點(diǎn)及形狀不同，在電場中的遷移速度不同。以醋酸纖維素薄膜為支持物，正常人血清在pH8.6的緩沖體系中電泳，染色后可顯示5條區(qū)帶。其中白蛋白的泳動速度zui快，其余依次為α1－、α2－、β－及γ－球蛋白。這些區(qū)帶經(jīng)洗脫后可直接進(jìn)行光吸收掃描自動繪出區(qū)帶吸收峰及相對百分比。
試劑和器材
一、試劑
*緩沖液（pH 8.6，離子強(qiáng)度0.07）：*1.66 g，*鈉12.76 g，加水至1000 ml。
置4℃冰箱保存，備用。
染色液：氨基黑10B 0.5 g，甲醇50 ml，冰醋酸10 ml，蒸餾 水40 ml，混勻。
漂洗液：含95%乙醇45 ml，冰醋酸5 ml，蒸餾 水50 ml，混勻。
透明液：冰醋酸25 ml，無水乙醇75 ml，混勻。
二、材料
新鮮血清（未溶血）
三、器材
醋酸纖維薄膜（2×8 cm），培養(yǎng)皿，點(diǎn)樣器，電泳儀 ，玻璃板，粗濾紙 ，鉛筆和直尺，竹鑷子
四、操作方法
1. 浸泡：用鑷子取醋酸纖維薄膜1張（識別光澤面和無光澤面，并在角上用筆做上記號），小心平放在盛有緩沖液的平皿中，浸泡30min左右。
2. 點(diǎn)樣：將浸透的薄膜從緩沖液取出，夾在兩層粗濾紙 內(nèi)吸干多余的液體，然后平鋪在玻璃板上（無光澤面朝上），使其底邊與模板底邊對齊。點(diǎn)樣時(shí)，先在點(diǎn)樣器上均勻地沾上血清，再將點(diǎn)樣器輕輕地印在點(diǎn)樣區(qū)內(nèi)，使血清*滲透至薄膜內(nèi)，形成一定寬度、粗細(xì)均勻的直線。點(diǎn)樣區(qū)距陰1.5 cm處。
圖一、醋酸纖維素薄膜規(guī)格及點(diǎn)樣位置示意圖（虛線處為點(diǎn)樣位置）
3. 電泳：根據(jù)電泳槽膜支架的寬度，裁剪尺寸合適的濾紙條。在兩個(gè)電極槽中，各倒入等體積的電泳緩沖液，在電泳槽的兩個(gè)膜支架上，各放兩層濾紙條，使濾紙一端的長邊與支架前沿對齊，另一端浸入電泳緩沖液中。當(dāng)濾紙全部潤濕后，用玻璃棒輕輕擠壓在膜支架上的濾紙以驅(qū)趕氣泡，使濾紙的一端能緊貼在膜支架上，即為濾紙橋。將點(diǎn)樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上（點(diǎn)樣面朝下），另一端平貼在陽支架上。蓋上電泳槽蓋，使薄膜平衡10min。通電，調(diào)節(jié)電流強(qiáng)度0.4－0.6mA/cm膜寬度，電泳時(shí)間約1~1.5小時(shí)。
圖二、醋酸纖維薄膜電泳裝置示意圖
1. 濾紙橋 2. 電泳槽 3. 醋酸纖維素薄膜 4. 電泳槽膜支架 5. 電極室*隔板
4. 染色：電泳完畢后將薄膜取下, 放在染色液中浸泡10 min。
5. 漂洗：將薄膜從染色液中取出后移置漂洗液中漂洗數(shù)次，直至背景藍(lán)色脫凈。取出薄膜放在濾紙上，用吹風(fēng)機(jī)將薄膜吹干。
6. 透明：將脫色吹干后的薄膜浸入透明液中，浸泡2~3分鐘后，取出緊貼于潔凈玻璃板上，兩者間不能有氣泡，干后即為透明的薄膜圖譜。
圖三、血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳圖譜示意圖
注意事項(xiàng)
（1）市售醋酸纖維素薄膜均為干膜片，薄膜的浸潤與選膜是電泳成敗的關(guān)鍵之一。若飄浮于液面的薄膜在15~30 s 內(nèi)迅速潤濕，整條薄膜色澤深淺一致，則此膜均勻可用于電泳。
（2）醋酸纖維素薄膜電泳常選用pH8.6*－*鈉緩沖液，其濃度為0.05~0.09 mol/L。選擇何種濃度與樣品和薄膜的厚薄有關(guān)。緩沖液濃度過低，則區(qū)帶泳動速度快區(qū)帶擴(kuò)散變寬；緩沖液濃度過高，則區(qū)帶泳動速度慢，區(qū)帶分布過于集中，不易分辨。
（3）點(diǎn)樣時(shí)，應(yīng)將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，以免引起樣品擴(kuò)散。但不宜太干，否則樣品不易進(jìn)入膜內(nèi)，造成點(diǎn)樣起始點(diǎn)參差不起，影響分離效果。
（4）點(diǎn)樣時(shí)，動作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。
（5）電泳時(shí)應(yīng)選擇合適的電流強(qiáng)度，一般電流強(qiáng)度為0.4~0.6 mA/cm膜寬度。電流強(qiáng)度高，則熱效應(yīng)高；電流過低，則樣品泳動速度慢且易擴(kuò)散。
