篩選之前確定G418濃度：
1. 由于每種細(xì)胞對G418的敏感性不同，而且不同的廠家生產(chǎn)的G418有效成分的比重不同，一般1 g 的粉劑中有效的G418含量大約為0.722 g。
2. G418是*的類似物，兩者都是通過抑制核糖體的功能和蛋白質(zhì)的合成而殺死細(xì)胞的。但是*對真核細(xì)胞無作用而G418對細(xì)菌和真核細(xì)胞都起作用。neo就是編碼3‘磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因，它表達(dá)的蛋白能夠分解*和G418。在進(jìn)行轉(zhuǎn)染時細(xì)胞膜受到影響，抗生素可能對細(xì)胞產(chǎn)生較大影響，加上G418有殺菌作用，所以有人主張轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染時不加其它抗生素。
3. 匯合度對G418篩選結(jié)果的影響很大，一般篩選時匯合度不宜超過50%
4. G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定G418的*篩選濃度。具體如下：將細(xì)胞稀釋到1000個細(xì)胞/ml，在100 ug/ml~1 mg/ml 的G418濃度范圍內(nèi)進(jìn)行篩選，選擇出在10~14天內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的zui低G418濃度來進(jìn)行下一步的篩選試驗。一個具體試驗：3×106個細(xì)胞電轉(zhuǎn)后，分別接種1/4000，1/1000，1/300細(xì)胞到24孔板中，48h后加藥篩選，此時1/300細(xì)胞孔內(nèi)大約50%匯合度。理論上1/4000孔內(nèi)應(yīng)有4%的匯合度。篩選9天后，觀察1/4000孔內(nèi)有兩三個克隆，按比例1/300孔內(nèi)應(yīng)該有幾十個克隆，事實上，它們幾乎全死光了，只有幾個克隆。
加藥時間和維持濃度
1. 由于基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)之后要一段時間才能表達(dá)出蛋白質(zhì)。所以篩選不能太早；但是也不能太晚，因為轉(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷較大，增值較慢，時間長了就會被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒，zui終導(dǎo)致篩選不出陽性，一般要在轉(zhuǎn)染24小時之后才開始加G418篩選。隨著細(xì)胞的代謝G418的濃度和活性都回下降，所以每3~5天都要更換一次含有G418的篩選液。這時藥物濃度可以降至200 ug/ml。
2. 加抗生素的時機，主要是考慮插入到細(xì)胞基因組的抗性基因是否已經(jīng)得到表達(dá)。一般是轉(zhuǎn)染48小時后加入抗生素。挑出單后就可以用維持濃度，一般是篩選濃度的1/2。
關(guān)于維持濃度，有人說細(xì)胞會出現(xiàn)對抗生素的抗性，應(yīng)不斷提高其濃度。而且，如果你要挑選到幾個陽性克隆中較高表達(dá)的的話，可以調(diào)整抗生素的濃度。當(dāng)然，抗性基因高表達(dá)，目的基因不一定就跟著高表達(dá)。
篩選時的培養(yǎng)液
加藥篩選約6天左右，細(xì)胞會大量死亡，孔中只剩下的細(xì)胞。這時會出現(xiàn)兩個問題：
1. 死亡的細(xì)胞會裂解釋放出有害物質(zhì)，導(dǎo)致那些有neo表達(dá)的陽性細(xì)胞死亡，即非選擇性死亡，因此要及時換液
2 . 孔中細(xì)胞數(shù)目很少，細(xì)胞之間的信號會變得很弱，也會導(dǎo)致陽性細(xì)胞的狀態(tài)不佳甚至死亡。這個時候需要一種特殊的培養(yǎng)液：假如你要轉(zhuǎn)染3T3細(xì)胞，在3T3細(xì)胞匯合度達(dá)到80%的時候，換液，培養(yǎng)過夜之后收集培養(yǎng)液，通過濾器消毒，和新鮮的培養(yǎng)液按1：1混合備用。再轉(zhuǎn)染后篩選過程中就可以應(yīng)用這種培養(yǎng)基。
3. 適當(dāng)增加血清濃度。
篩選時出現(xiàn)的問題及其解決辦法：
1. 問題1。做hela細(xì)胞的篩選，現(xiàn)在已經(jīng)篩選3周，在6孔板中已經(jīng)長出一些細(xì)胞簇，想把它挑到96孔板中，就用2 ul *消化，在消化過程中，*擴散，細(xì)胞已經(jīng)四散開，和周圍的其它細(xì)胞簇融合在一起（我的細(xì)胞簇離的很近），就是說幾個細(xì)胞簇被*融合在一起，那樣根本沒有辦法做下去了，該怎么辦？
（1）可以減少*量；*在加入之前要用37度溫箱預(yù)熱，并且PBS潤洗細(xì)胞層，以減少可能殘存的血清的影響；
（2）加入*后，稍過幾秒鐘就可以吸走消化液了，不用吸干凈，然后放到37度溫箱中繼續(xù)作用1 min，這時，消化酶可以繼續(xù)作用的，又可避免*擴散；
（3）顯微鏡下觀察細(xì)胞*松散開，就可以在你感興趣的局部加培養(yǎng)基，并吸走你的可隆了呀
（4）具體消化的時間，你注意摸索一下，如果在步驟2中顯微鏡下見細(xì)胞尚未*松散開，可以再重復(fù)的，直到松散開，能夠被吸走為止。
我的建議：1. 在100 mm dish中挑克隆，細(xì)胞分的稀一點。2. 把細(xì)胞全部消化下來，在96孔板中逐步稀釋獲得單
2. 問題2。篩選成功的概率：只要有抗性加壓篩選，挑選到的機率還是比較大的。一般能挑到穩(wěn)定表達(dá)的概率我認(rèn)為大概有70~80%，但是想挑到表達(dá)量高且能穩(wěn)定表達(dá)的，不大容易。這個可能是在染色體上，合適的整合位點太少的緣故。
3. 問題3。細(xì)胞形態(tài)的改變：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后陽性均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞形態(tài)的改變。
想請教各位有經(jīng)驗的高手，你們做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時有此發(fā)現(xiàn)嗎？我的也是，而且好象還有好幾種不同類型的細(xì)胞。不過，我轉(zhuǎn)的是一種抑癌基因。
4. 問題4。單克隆化的時機和個數(shù)：加藥篩選時， 一般等到確認(rèn)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞長到70%以上時，再做有限稀釋法，以克隆出陽性細(xì)胞，同時要保持適當(dāng)?shù)乃幬餄舛?，以防突變和污染。若?xì)胞長好了，如有40%以上，就可以有限稀釋了一般，篩選5，6個克隆就有需要的，但保險起見，篩10個吧。
5. 從單化時開始，就要加大營養(yǎng)，清和生長因子。
單化的操作方法：
1. 方法1。單克隆細(xì)胞的培養(yǎng)就是這樣的，我現(xiàn)在作了15個96孔板的單克隆，總共才得到大約50株單克隆在做時候應(yīng)保證每個孔中的細(xì)胞是一個，因此，我一般在200毫升的培養(yǎng)液中加入小于96個的細(xì)胞，這樣平均到每個孔中因該可以由滿意的結(jié)果你所說的現(xiàn)象我也遇到過，我也百思不得其解，只好做多一點的96孔板來補充。培養(yǎng)SPC-A1（人肺癌細(xì)胞），轉(zhuǎn)染了EGFP，然后進(jìn)行了G418抗性篩選和96孔板單篩選，zui終獲得了成功將我的實驗步驟寫出來，希望對你有所幫助。
2. 方法2。實驗步驟大致為：預(yù)先對96孔板除*排之外的所有孔加含15%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，0.1 ml/孔，并放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育，然后*消化穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞，細(xì)胞液稀釋至密度為1000 cell/ml 的單細(xì)胞懸浮液，上述細(xì)胞液接種于96孔板的*排，0.2 ml/孔，從中吸取0.1 ml 細(xì)胞溶液接種于第二排，混合后，從第二排中吸取0.1 ml 接種于第三排……，一直到第八排，zui后一排都丟棄0.1 ml 細(xì)胞液。一般來說，每一列都會有某個孔中只有1~2個細(xì)胞。
3. 方法3。我的改進(jìn)之處：我在顯微鏡下觀察，標(biāo)記孔中小于10個細(xì)胞的孔，然后在顯微鏡下用記號筆在皿底把單個熒光細(xì)胞圈住，然后在操凈臺里用滅過菌底牙簽將圈外的細(xì)胞戳死，這樣留在孔中的就是單克隆了，通過這樣的，我一共獲得了6株單。但需注意的是：時間不能超過30min，否則細(xì)胞極容易死亡。解決操作時間長的方法：拿一個96板，在里面隨便種一些細(xì)胞，然后用牙簽練習(xí)，我練了5~6次后非常熟練了
培養(yǎng)液：是含15%的胎牛血清，加大營養(yǎng)，有利于細(xì)胞生長；另外一種方法是對還沒有變黃的細(xì)胞液進(jìn)行過濾，過濾后的培養(yǎng)含有很多生長因子，可以作為單的培養(yǎng)液。
4. 方法4。我曾經(jīng)幫同事做過挑單克隆，直接將倒置顯微鏡搬到操凈臺內(nèi)紫外照射30分鐘，然后先在顯微鏡下把要挑的單克隆初看一遍，算一下大概要挑幾個，然后在96孔板內(nèi)先加好培養(yǎng)基，再將6孔板內(nèi)的培養(yǎng)基吸出，加入少量的*，大概能蓋住板底即可，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，在有些變圓時，即用10ul槍在顯微鏡下直接吸克隆，放入事先準(zhǔn)備好的加了培養(yǎng)基的96孔板內(nèi)，先吸大的克隆，在**起到作用使細(xì)胞松散擴散開了時，已經(jīng)吸了將近十個克隆了，動作快一些時能吸十幾個，我做過幾次了效果很好，沒有出現(xiàn)污染。（在要進(jìn)行操作時，用酒精將手好好擦擦，將顯微鏡用新潔爾滅也擦一下，一般不會有什么問題），你可以試試，只要小心一些就行了。
5. 方法5。關(guān)于穩(wěn)轉(zhuǎn)的方法，好像園子里很多xdjm都用的是有限稀釋法來作，但是我們實驗室基本上都不用九十六孔做有限稀釋來作單的，一般的做法都是這樣：
（1）3.5 cm 皿鋪細(xì)胞，長到大概80%以上的時候作轉(zhuǎn)染。
（2）轉(zhuǎn)染后一天消化，傳到一個大皿（1：6）或者兩個大皿（1：12）。
（3）再過一天后加入帶G418的培養(yǎng)基。
（4）依據(jù)細(xì)胞不同，大概從加入G418的第三天到第八天之間細(xì)胞開始出現(xiàn)大量死亡，活下來的細(xì)胞就形成單。
（5）單長到相對較大的集落后，于顯微鏡下用200 ul 槍挑取細(xì)胞集落，一般挑上48個，種在兩塊24孔板上。
（6）于24孔板上繼續(xù)培養(yǎng)，約4、5天后即可消化傳代，取部分作收蛋白western之用，根據(jù)western結(jié)果確定真陽性。
單化后細(xì)胞特點和處理：
1. 單后細(xì)胞生活習(xí)性改變：考慮質(zhì)粒的表達(dá)對細(xì)胞的生長有一定的影響，查文獻(xiàn)確認(rèn)一下。
2. 單后的培養(yǎng)需要多加些血清，再傳代時保證板子不影響細(xì)胞貼壁，避免出現(xiàn)傳代后細(xì)胞浮起來后死亡的現(xiàn)象。
3. 篩選成單后，不加藥培養(yǎng)2代，再加藥繼續(xù)篩選兩代，此時如果不出現(xiàn)死亡細(xì)胞則可以認(rèn)為是穩(wěn)定細(xì)胞系。復(fù)蘇后加G418傳代2次，然后按部就班。
4. 過一段時間再篩選時，G418的濃度有人認(rèn)為需要比穩(wěn)轉(zhuǎn)時小寫，此外，加藥后對蛋白質(zhì)的表達(dá)，細(xì)胞形態(tài)有影響，因此做功能時要停藥培養(yǎng)合適時間后再做。
5. 穩(wěn)轉(zhuǎn)PA317細(xì)胞后再此篩選（需要隔一段時間再加壓篩一次），細(xì)胞也是死的厲害，不過還是可以篩到，不過需要用合適的濃度。可以在細(xì)胞傳幾代后，分出一小部分，不加G418培養(yǎng)一段時間，然后再加你維持細(xì)胞的抗性的G418濃度培養(yǎng)一天看細(xì)胞會不會死亡，如果死亡，說明外源基因還沒有丟失。
6. 有人這樣做的：轉(zhuǎn)染加藥一段時間后，板子上出現(xiàn)了幾個克隆，如果有幾十個克隆，然后挑其中七八個到24孔板里繼續(xù)加藥篩選，等24孔長滿后再轉(zhuǎn)到6孔板繼續(xù)加藥篩選，6孔板里長差不多滿后，每孔消化下來大概一半做WB鑒定目的基因表達(dá)，剩一半留著繼續(xù)加藥培養(yǎng)，等WB結(jié)果出來有陽性的孔就保留下來，陰性的丟掉。
單化后鑒定：
1. 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)目的基因并不上調(diào)，瞬時轉(zhuǎn)染表達(dá)是增高的。原因：瞬轉(zhuǎn)是在強啟動子下，穩(wěn)轉(zhuǎn)時你得到的細(xì)胞株可能失去了此啟動子，或者是改變了細(xì)胞的生理特性!用WB和瞬轉(zhuǎn)對照鑒定一下！
2. 轉(zhuǎn)染后質(zhì)粒整合到基因組是隨機的，一般兩月后（傳代10代以上）還表達(dá)你想要蛋白的單可以認(rèn)為是整合了質(zhì)粒的。
